[发明专利]响应Fe(Ⅱ)离子的生物发光荧光素的合成方法及其应用

说明书

本发明公开了一种响应Fe(Ⅱ)离子的生物发光荧光素的合成方法及其应用，将对二甲氨基肉桂酸、1,2‑双‑(乙氧基羰基)亚乙基三苯基膦烷反应合成第一化合物，之后溶于异丙醇和NaOH混合溶液并反应、调节PH值之后得第二化合物，之后溶于PBS溶液滴加间氯过氧苯甲酸乙酸乙酯溶液，反应后得第三化合物，之后溶于N,N‑二甲基甲酰胺DMF，加入K2CO3和三乙胺搅拌溶解后滴加叔丁基保护的S‑三苯甲基‑D‑半胱氨酸，室温反应、萃取洗涤、过色谱柱分离后得第四化合物，之后脱去三苯基保护基团所得混合物溶于水，加入酯酶室温水解过夜、分离纯化后得生物发光荧光素O‑Akalumine。本发明的生物发光荧光素可特异性响应Fe(Ⅱ)并生成活性Akalumine荧光素，与荧光素酶反应后生物发光，体外Fe(Ⅱ)响应浓度低至0.1μM，可用于细胞Fe(Ⅱ)成像检测。

技术领域

本发明涉及分子影像技术领域，特别涉及响应Fe(Ⅱ)离子的生物发光荧光素的合成方法及其应用。

背景技术

脑出血(Intracerebral Hemorrhage，ICH)通常指非外伤性脑实质出血，约占所有脑卒中的24％，具有较高的死亡率和发病率，脑出血发生后，血红蛋白(Hb)降解所释放的大量Fe(Ⅱ)在血肿周围水肿区域逐渐聚积，过量的Fe(Ⅱ)通过过氧化作用破坏血脑屏障，引起铁依赖的细胞死亡和神经损伤。

Fe(Ⅱ)在脑出血的继发性损伤中的作用已得到广泛的证实，有研究者试图通过铁螯合剂甲磺去铁胺或米诺环素干预铁代谢以缓解Fe(Ⅱ)导致的神经毒性，II期临床试验发现甲磺去铁胺治疗组在180d的神经恢复情况优于对照组。因此，通过MRI等非侵入影像方法量化血肿周围水肿中的Fe(Ⅱ)的浓度，不仅有助于指导治疗和评估预后，更有助于了解ICH中Fe(Ⅱ)介导的水肿及神经损伤机制。

为获取脑部铁离子浓度，目前已有可用于总铁成像的序列包括T2*WI，SWI，R2*，QSM等技术；其中T2*WI和QSM可将顺磁性物质(如铁、铁蛋白和铁血黄素)与抗磁性物质(如钙、水或髓磷脂)区分开来，实现总铁定量。然而，目前的成像方法只能总铁成像，仍无法区分Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)，导致准确定量血肿周围水肿中Fe(Ⅱ)浓度依然是面临巨大的挑战。因此，开发响应Fe(Ⅱ)离子的生物发光荧光素的合成方法并应用于细胞Fe(Ⅱ)定量MRI成像成像检测中，显得尤为迫切和重要。

发明内容

本发明的目的在于，针对现有技术的上述不足，提供一种响应Fe(Ⅱ)离子的生物发光荧光素的合成方法及其应用，该生物发光荧光素可特异性响应Fe(Ⅱ)并生成活性Akalumine荧光素，与荧光素酶反应后生物发光，体外Fe(Ⅱ)响应浓度低至0.1μM，可用于细胞Fe(Ⅱ)成像检测。

本发明为达到上述目的所采用的技术方案是：

一种响应Fe(Ⅱ)离子的生物发光荧光素的合成方法，包括以下步骤：

S1：用对二甲氨基肉桂酸、1,2-双-(乙氧基羰基)亚乙基三苯基膦烷反应合成得到第一化合物；

S2：将所得第一化合物溶于异丙醇和NaOH混合溶液中并室温搅拌24小时后，调节PH值析出沉淀，有机相经低压移除溶剂，合并固体经干燥即得第二化合物；

S3：将所得第二化合物溶于PBS溶液后滴加间氯过氧苯甲酸乙酸乙酯溶液，搅拌反应后，收集水相，干燥即得淡黄色固体第三化合物；

S4：将所得第三化合物溶于N,N-二甲基甲酰胺DMF中，加入K2CO3和三乙胺搅拌溶解后，滴加叔丁基保护的S-三苯甲基-D-半胱氨酸，室温搅拌反应，反应产物溶解于超纯水中，经萃取洗涤、过色谱柱分离后，得到第四化合物。

S5：将所得第四化合物在三苯基氧磷和三氟甲磺酸酐条件下脱去三苯基保护基团，得到第五化合物的混合物，所得混合物溶解于水中，加入酯酶室温水解过夜，色谱柱分离纯化后得到生物发光荧光素O-Akalumine。