[发明专利]一种黄素单加氧酶突变体及其制备和应用

说明书

本发明属于酶的基因工程技术领域，具体涉及一种酶活性提升的黄素单加氧酶突变体及其制备与应用。通过全基因合成来自大蒜(Allium sativum)的野生型黄素单加氧酶基因，利用易错PCR技术对野生型黄素单加氧酶基因进行随机突变，得到黄素单加氧酶突变体N91G，及其编码基因asfmom，重新构建重组质粒，并实现了其在大肠杆菌和毕赤酵母中的高效表达，通过发酵、提取等技术获得活性进一步提高的黄素单加氧酶。

技术领域：

本发明属于酶的基因工程技术领域，具体涉及一种酶活性提升的黄素单加氧酶突变体及其制备与应用。

背景技术：

黄素单加氧酶(Flavin-containing monooxygenase,FMO,EC 1.14.13.8)，是一种能在C、N和S原子上加氧的酶，催化氧气的一个氧原子与电子供体提供的氢原子结合生成水，另外一个氧原子插入有机底物，形成新的产物，这一反应严格依赖于辅因子。蒜氨酸，是大蒜中独有的含硫化合物，可作为天然防腐剂，对各种真菌的杀灭作用强度与化学防腐剂苯甲酸、山梨酸相近似；具有抗氧化和清除自由基的活性，可以延缓衰老；同时具有抗菌杀毒、抗肿瘤、协同降血压等重要的药理功效。因此，可以利用黄素单加氧酶催化脱氧蒜氨酸制备具有多种生物活性功能的蒜氨酸，这些酶法合成的蒜氨酸可应用于食品防腐剂、食品调味料、保健食品、药物等，具有极大的利用价值和应用前景。

目前，人们主要通过提取法和化学合成法获得蒜氨酸，酶法合成使用较少。然而，酶法合成因其安全、高效和高产等特点，逐渐受到关注。酶法合成优势主要在于以下几点：首先酶法合成比化学法合成更安全和绿色，成本更低；其次，提取法效率低，提取过程由于蒜氨酸与蒜氨酸酶反应，产生大量蒜素，从而降低了蒜氨酸的品质；酶法合成蒜氨酸，利用了微生物生长繁殖快，易于控制等特点，可以按照意愿大量合成蒜氨酸。

黄素单加氧酶的应用严格受限于其活性、专一性、最适温度和pH值、温度和酸碱稳定性、溶剂耐受性等酶学性质。因此，需要不断提高酶的活性，获得高产的蒜氨酸，从而实现蒜氨酸的工业化生产。然而，已报道的能催化脱氧蒜氨酸生成蒜氨酸的黄素单加氧酶极少，而且催化效率和转化率较低。在实际生产过程中，酶活性低不仅限制了其应用范围，还增加了工业应用成本，为实际应用带来困难。因此，筛选到高活性的黄素单加氧酶具有重要研究意义。为了解决这些实际应用问题，研究者通过蛋白质工程技术来改善天然酶的功能及特征，以满足工业上的应用，例如定向进化、理性设计、化学修饰等。

定向进化是改善酶的功能和特性的重要手段之一，尤其在提高酶的催化活性方面。它属于蛋白质的非理性设计，不需要获得蛋白质的高级结构以及催化位点等信息，只需对蛋白质氨基酸序列做随机突变。它可以在实验室里模拟自然选择的进化机制，通过分子生物学手段在体外快速建立含大量目的蛋白编码基因的突变体文库，并通过高通量的定向筛选方法，快速获得符合人类应用价值的蛋白质突变体。定向进化的核心步骤主要包括构建具有多样性的突变体文库和高通量的筛选方法。常用的包括：易错PCR、饱和突变、DNA改组、交错延伸PCR等。定点突变，即理性设计，在蛋白质的空间结构、活性位点、催化机制等基础上，有的放矢对其进行改造，且只能对天然酶蛋白质中的少数氨基酸进行替换、删除或插入，不改变酶蛋白的高级结构，对酶功能和特性的改造有限。因此，对于结构与功能未知的酶，定向进化可在一定程度上弥补理性设计的不足。

大肠杆菌外源基因表达系统是目前研究得最深入、发展也最完善的表达系统，许多有价值的多肽和蛋白质已在大肠杆菌中实现了高效表达。它已作为一种安全、高效、多功能和极具开发潜力的微生物菌种已广泛地应用于工业、农业、医药、卫生、食品、畜牧业、水产及科研领域。