[发明专利]一种重症肌无力EAMG小鼠骨骼肌模型的建立方法

权利要求书

1.一种免疫强化的EAMG小鼠模型的建立方法，其特征在于：包括如下步骤：S1：准备若干个小鼠，并饲养一段时间；

S2：给小鼠配置用于诱导小鼠成模的免疫制剂；

S3：麻醉小鼠，给小鼠注射免疫制剂；

免疫制剂包括第一免疫制剂、第二免疫制剂，给小鼠注射第一免疫制剂，间隔一段时间后注射第二免疫制剂，间隔一段时间后再次注射第二免疫制剂；

所述第一免疫制剂包括抗乙酰胆碱受体和弗氏完全佐剂，所述第二免疫制剂包括抗乙酰胆碱受体和弗氏不完全佐剂；

S4：成熟树突状细胞和胸腺瘤细胞系体外共同培养高抗原提呈能力的树突状细胞；

S5：每间隔一段时间，小鼠注射S4中得到的高抗原提呈能力的树突状细胞，连续注射若干次；

S6：第一次注射免疫制剂一段时间后，对所有小鼠进行最后Lennon评级，阳性者结束此次实验；

高抗原提呈能力的树突状细胞的制备包括：从胸腺瘤细胞系细胞中提取RNA，并将其逆转录为cDNA；通过Atg12基因上、下游引物扩增Atg12基因片段并插入质粒载体pc3.1(+)中，得到重组质粒pc3.1(+)-Atg12；将获得的重组质粒pc3.1(+)-Atg12转染胸腺瘤细胞系细胞，得到高自噬水平胸腺瘤细胞；

所述步骤S4中的胸腺瘤细胞系是胸腺瘤细胞系Thy0517。

2.根据权利要求1所述的一种免疫强化的EAMG小鼠模型的建立方法，其特征在于：所述步骤S1中选取周龄6-8周的SPF级C57BL/6小鼠；

所述步骤S5中每次每只小鼠输注细胞数量为0.5×10⁶~1×10⁶；

所述步骤S6中的一段时间为98天。

3.根据权利要求1所述的一种免疫强化的EAMG小鼠模型的建立方法，其特征在于：所述步骤S4中高抗原提呈能力的树突状细胞的培养，包括如下步骤：

A1：取出在液氮中保存的胸腺瘤细胞系Thy0517，配置成细胞悬液，观察细胞活性；

A2：从胸腺瘤细胞系细胞中提取RNA，并将其逆转录为cDNA；通过Atg12基因上、下游引物扩增Atg12基因片段并插入质粒载体pc3.1(+)中，得到重组质粒pc3.1(+)-Atg12；将获得的重组质粒pc3.1(+)-Atg12转染胸腺瘤细胞系细胞，得到高自噬水平胸腺瘤细胞；

A3：取出在液氮中保存的复苏人急性单核细胞白血病细胞，配置成细胞悬液，观察细胞活性；

A4：复苏人急性单核细胞白血病细胞在诱导树突状细胞成熟混合因子A和诱导树突状细胞成熟混合因子B的作用下，得到成熟树突状细胞；

A5：将步骤A2中得到的高自噬水平胸腺瘤细胞和A4中得到的成熟树突状细胞共同培养若干天，得到抗原提呈能力增强的树突状细胞；

诱导树突状细胞成熟混合因子A由终浓度150±50ng/u1的12-0-十四烷酰基佛波醇-13-乙酸酯、终浓度60±20ng/ul的重组人白细胞介素-4、终浓度40±10ng/ul的重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和余量为浓度50mg/mL海藻糖PBS溶液组成；

诱导树突状细胞成熟混合因子B由终浓度7±3ng/ul的细胞用脂多糖、终浓度7±3ng/ul的重组人白细胞介素-6,余量为浓度50mg/mL的海藻糖PBS溶液组成。

4.一种重症肌无力EAMG小鼠骨骼肌模型的建立方法，根据权利要求1-3任一项所述的一种免疫强化的EAMG小鼠模型的建立方法，其特征在于：包括以下方法中的一种或几种方法：

（1）使用CT扫描确定EAMG鼠脊柱弯曲角度；

（2）使用¹⁸F-FDG PET/CT扫描检测肌肉代谢功能情况；

（3）使用多重组织病理染色明确EAMG鼠肌肉分子靶点；

（4）对动物模型进行Lennon评分检测；

（5）对动物模型进行肌电图检测；

（6）对动物模型进行血清AChR抗体检查。