[发明专利]一种免疫强化的EAMG小鼠模型的建立方法

说明书

本发明提供了一种免疫强化的实验性自身免疫性重症肌无力（(Experimental Autoimmune Myasthenia Gravis，EAMG）小鼠模型的建立方法，在AchR肽段免疫诱导成模的基础上，续惯注射胸腺瘤细胞系Thy0517刺激培养的树突状细胞，并辅以氢氧化铝佐剂，建立了该模型。本发明公开的免疫强化的EAMG小鼠模型，通过增强树突状细胞抗原呈递能力可使小鼠体内保持稳定的免疫强化状态，且成模周期从110±3天有效缩短为98±3天。同时，利用肌肉多模态检测验证该小鼠模型相关的特征性改变。为重症肌无力的探索研究提供了稳定的模型。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及EAMG小鼠模型的建立方法，具体而言，涉及一种免疫强化的EAMG小鼠模型的建立方法。

背景技术

重症肌无力（Myasthenia gravis，MG）是一种自身免疫性疾病，其特征是机体产生自身抗体对神经肌肉接头处的不同靶标进行攻击，从而引起肌肉疲劳和虚弱。根据自身抗体的靶标，MG可分为以肌肉型乙酰胆碱受体（Acetylcholine receptor，AchR）为靶标的肌无力；由于自身抗体结合了肌肉特异性酪氨酸激酶导致的MG；自身抗体攻击凝集素受体低密度脂蛋白受体相关蛋白4后产生的肌无力；以 LRP4配体为靶标的自身抗体而导致的MG；不明原因或无法查明靶标的肌无力。其中，超过85%的重症肌无力患者发病都是由针对神经肌肉接头处的AChR抗体引起的。重症肌无力主要损害骨骼肌，随着临床与神经免疫研究的进展发现除了骨骼肌受累外，重症肌无力还可能累积其他肌群，但目前对肌无力背景下其他肌群的变化情况认识仍尚不深入。

实验性自身免疫性重症肌无力(Experimental autoimmune myasthenia gravis，EAMG)小鼠是研究此类疾病经典的动物模型。通过建立实验性重症肌无力动物模型, 探讨发病机理及免疫治疗的方法, 有助于阐明自身免疫性疾病的发病机制,寻找探索自身免疫性疾病发病机制的新途径。由于在众多MG病例中，针对乙酰胆碱受体产生自身抗体激活补体系统引起神经肌肉接头处发生功能障碍并减少功能性的AchR从而发生MG的比例占据绝大多数，因此通过AChR免疫诱导的EAMG模型是最常见和最成熟的造模方式。传统的EAMG模型包括从加利福尼亚电鳐的电器官及眼镜蛇毒素中提取并纯化AchR蛋白作为免疫原对实验动物进行主动免疫造模，但由于加利福尼亚电鳐以及用于纯化的眼镜蛇神经毒素等原材料获取较为困难，因此该方法的应用受到了很大的局限。此外，国内外研究人员还发明了利用重组人AchR建立EAMG模型或使用人工合成AchR多肽主动免疫建立EAMG模型。其中较常见的是利用AchR多肽构建的小鼠或大鼠EAMG模型。该模型的构建主要通过将弗氏佐剂与人工合成的AchR多肽充分乳化后注入老鼠体内，佐剂中包含的AchR可使老鼠产生AchR自身免疫性抗体，在神经肌肉接头处形成大量IgG和补体沉积，诱发肌无力产生。虽然AchR肽段制备与注射技术相对简单且成熟，但由于注射AchR诱发的免疫反应为主动免疫，在动物体内须经T细胞抗原处理呈递再由B细胞生成抗体，这一过程相对较长同时也增加了成模不稳定性。本发明采用了C57BL/6小鼠，在注射人工合成AchR肽段-弗氏佐剂的基础上，续惯注射一种经优化的胸腺瘤细胞刺激的抗原提呈能力增高的树突状细胞，从而构建一种免疫强化的EAMG模型。高抗原提呈能力的树突状细胞的加入大大提高了AchR多肽经T、B细胞免疫反应刺激动物机体产生自免性抗体的效率，使成模时间更短且模型稳定, 有助于利用此模型进行进一步研究。此外，我们在注入树突状细胞的同时还添加了氢氧化铝佐剂，通过增强MHCⅡ类分子和CD80、CD86等共刺激分子的表达增强树突状细胞对抗原的摄取，改变抗原提呈的强度和作用时间，推动了EAMG模型的快速稳定建立。