[发明专利]一种基于LC-MS/MS技术检测人血浆中吡非尼酮浓度的方法

说明书

本发明公开了一种基于LC‑MS/MS技术检测人血浆中吡非尼酮浓度的方法，取用50μL血浆样品进行简单的蛋白沉淀处理后测定吡非尼酮浓度，该方法前处理简单、质谱采集时间短、成本低廉、方便实验室进行大规模临床样本检测。

技术领域

本发明属于医药检测技术领域，具体涉及一种基于LC-MS/MS技术检测人血浆中吡非尼酮浓度的方法。

背景技术

特发性肺纤维化是指由不明原因引起，并以普通型间质性肺炎为特征性病理改变的一种慢性间质性肺疾病，是特发性间质性肺炎中最常见的类型。吡非尼酮（Pirfenidone，PFD）是一种新型口服小分子化合物，属于口服的吡啶类药物，具有抗纤维化、抗炎和抗氧化作用。特别适用于特发性肺纤维化，也适用于肝纤维化、心脏组织纤维化和多发性硬化症。

吡非尼酮对炎性细胞因子（TNF-α、IL-1、IL-6等）的生成表现出抑制作用，并对抗炎因子（IL-10）的生成表现出促进作用，通过改善向Th2型的偏向（修正Th1和Th2的平衡）抑制IFN-γ的降低，对纤维化形成相关增殖因子（TGF-β1、b-FGF、PDGF）的生成表现出抑制作用。综上，对各种细胞因子和增殖因子的产生具有调节作用。此外，吡非尼酮对纤维芽细胞的增殖也有抑制作用，并抑制胶原的产生。

目前吡非尼酮治疗药物检测的常见方法有：紫外分光光度法、高效液相色谱法。这些方法存在前处理复杂、定性定量不够准确、成本高、分析时间长、或对实验人员技术要求高等问题。液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）越来越广泛应用于药物、食品、环境、法医、临床等各个领域。LC-MS/MS具有灵敏度高，选择性强，准确性好等特点，在临床检测上适用范围远远超过放射性免疫检测和化学检测范围，是其他方法无可比拟的。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种基于LC-MS/MS技术检测人血浆中吡非尼酮浓度的方法，该方法前处理简单、质谱采集时间短、成本低廉、方便实验室进行大规模临床样本检测。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一方面，本发明提供一种基于LC-MS/MS技术检测人血浆中吡非尼酮浓度的方法，包括如下步骤：

采用高效液相串联质谱技术检测经过预处理的血浆样品，利用同位素内标法定量，以标准曲线血浆样品中吡非尼酮的浓度为横坐标，以吡非尼酮峰面积与内标的峰面积比值为纵坐标，建立标准曲线方程，将血浆样品中吡非尼酮与内标峰面积的比值代入标准曲线方程中，计算待测血浆中吡非尼酮的浓度。

进一步地，所述高效液相串联质谱的液相色谱条件为：

色谱柱：Poroshell 120 EC-C18，规格为4.6*50 mm，2.7μm；

流速：0.6 mL/min；

流动相：水相：0.1%甲酸水溶液，有机相：乙腈；

洗针液：体积比1:1:1:1:0.0004的甲醇:乙腈:异丙醇:水:甲酸的混合溶液；

柱温：室温；自动进样器温度：室温；

采用水相和有机相为混合流动相进行梯度洗脱，每个样品采集时间为3.5 min，进样体积为2 μL，流速为0.6 mL/min，流动相梯度洗脱参数如下：0 min，45%有机相；2 min，90%有机相；2.5 min，90 %有机相；2.6 min，45%有机相；3.5 min，停止。

进一步地，所述高效液相串联质谱的质谱条件为：采用电喷雾离子源的多反映监测模式，正离子扫描模式，吡非尼酮的离子对为：m/z 186.1→77.1，吡非尼酮内标的离子对为：m/z 191.1→81.2，扫描时间为200ms，离子化电压（IS）为5500V；离子源温度（TEM）：500℃，气帘气（CUR）：30 psi，入口电压（EP）为10V，碰撞气（CAD）：8 psi，雾化气（Gas1）：50psi，涡轮气（Gas2）：50 psi。