[发明专利]IL-8突变体及其应用

说明书

本发明属于蛋白质工程技术领域，具体涉及一种IL‑8突变体及其应用，IL‑8突变体为氨基酸序列如SEQ ID No：1所示、碱基序列如SEQ ID No：2所示的IL‑8抗原的突变体，突变位点为L25R。IL‑8突变体的氨基酸序列如SEQ ID No：5所示，其作为抗原用于制备IL‑8抗体和亲和层析柱。采用本发明的IL‑8突变体制备的亲和层析柱纯化特异性的IL‑8抗体时，在二者结合率变化不大的前提下，更容易洗脱分离，纯化的抗体纯度高，回收率得到极大的提高。

技术领域

本发明属于蛋白质工程技术领域，具体涉及一种IL-8突变体及其应用。

背景技术

白细胞介素8(IL-8或趋化因子(C-X-C基序)配体8，CXCL8)是一种由主要由巨噬细胞、上皮细胞、气道平滑肌细胞、内皮细胞等细胞类型产生的趋化因子。内皮细胞将IL-8分泌储存在囊泡中，即Weibel-Palade小体中，囊泡表面膜上有许多能够结合IL-8的受体，其中，研究最多的为G蛋白偶联受体CXCR1和CXCR2。IL-8在两种受体之间的亲和力不同，CXCR1＞CXCR2，通过一连串的生化反应被分泌出来，是先天免疫系统反应中的重要介质。IL-8有两个主要功能：一是它在靶细胞中诱导趋化性，主要是对中性粒细胞，但也有其他粒细胞，导致它们向感染部位迁移，刺激其发挥吞噬作用；二是IL-8是血管生成的有效启动子。在靶细胞中，IL-8诱导一系列迁移和吞噬所需的生理反应，例如细胞内Ca²⁺的增加、胞吐作用(例如组胺释放)等。通常，在机体免疫反应系统中巨噬细胞首先识别到异物抗原，因此是第一个释放IL-8以招募其他细胞的细胞。据报道，IL-8的单体和同二聚体形式都是趋化因子受体CXCR1和CXCR2的有效诱导剂。IL-8被认为在细支气管炎的发病机制中起作用，细支气管炎是一种由病毒感染引起的常见呼吸道疾病。IL-8是CXC趋化因子家族的成员和CXC趋化因子家族的其他十个成员的基因在染色体4q的区域中形成一个簇。研究发现IL-8与多种疾病尤其是肿瘤的发生发展关系密切，特异性地阻断IL-8及其受体CXCR1/2有望成为多种疾病的潜在治疗策略。故检测机体中IL-8的表达，在临床治疗检测中具有越来越重要的意义。

临床应用人体中IL-8的检测需要制备高亲和力和高纯度的单克隆抗体。目前国内外针对IL-8单克隆抗体的纯化主要是偶联IL-8抗原的亲和层析柱、ProteinA柱、Protein G柱等。ProteinA柱、Protein G柱的纯化收率和相对纯度较低，偶联IL-8抗原的亲和层析柱纯化的单抗虽然特异性好，纯度也相对较高，但是由于IL-8抗原亲和柱和抗体结合力强，对抗体的洗脱非常困难，收率较低。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术中存在的上述问题，提出了一种IL-8突变体及其应用，IL-8突变体的蛋白结构发生改变，从而降低了与IL-8单克隆抗体的亲和力，利用这一特点，本发明还提供了制备IL-8单克隆抗体纯化使用的亲和层析柱，以琼脂糖凝胶颗粒(sepharose4b)为载体，偶联IL-8突变体，可以快速、高效的得到高纯度IL-8单克隆抗体。

本发明的技术方案是：

根据已有IL-8序列信息，对IL-8氨基酸序列进行分析，筛选出对IL-8构象有明显影响的氨基酸位点，并通过引物设计对相应位点进行氨基酸突变。IL-8蛋白构象发生变化，从而影响IL-8与抗体的结合力。实验通过对IL-8蛋白突变，经过大量筛选，确定了C端的L25R突变位点能引起IL-8抗原与抗体亲和力的减弱，从而促成发明。

本发明一方面提供了一种IL-8突变体，为氨基酸序列如SEQ ID No：1所示、碱基序列如SEQ ID No：2所示的IL-8抗原的突变体，所述IL-8突变体的突变位点为L25R。本发明通过对IL-8蛋白突变实验，并经过大量筛选，确定了C端的L25R突变位点能引起IL-8抗原与抗体亲和力的减弱。