[发明专利]一种表达热休克蛋白Hsp70的重组乳酸乳球菌及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种表达热休克蛋白Hsp70的重组乳酸乳球菌及其制备方法和应用，通过PCR扩增Hsp70基因全序列并回收纯化，之后制备pNZ8149线性化载体，将两者进行同源重组连接反应，得到重组表达质粒pNZ8149‑Hsp70；制备感受态细胞，将重组表达质粒pNZ8149‑Hsp70通过电转化转入感受态细胞，制得高效表达Hsp70的重组乳酸乳球菌。本发明利用同源重组技术构建了重组Hsp70蛋白的乳酸菌表达体系，通过快速诱导可大量表达Hsp70，由于乳酸菌本身不含内毒素，因此无需进行蛋白纯化，可将诱导表达的蛋白连同菌液一同饲喂小鼠，然后再攻毒，经检测上述含Hsp70的菌液可减轻霉菌毒素对小鼠的伤害，对攻毒后的小鼠能起到很好的保护作用。

技术领域

本发明涉及重组蛋白制备以及乳酸菌发酵的技术领域，尤其涉及一种表达热休克蛋白Hsp70的重组乳酸乳球菌及其制备方法和应用。

背景技术

1978年，Laskey等首次提出了分子伴侣(molecular chaperone)的概念，并将辅助组蛋白和DNA在体外组装成核小体的蛋白质命名为“molecular chaperone”。经过四十多年的研究，发现分子伴侣具有辅助蛋白质折叠、运输，降解错误折叠的蛋白质以及抑制蛋白质聚集的功能，对维持蛋白质稳态(proteostasis)至关重要，从而给出了“molecularchaperone”的定义。热休克蛋白(heat shock protein，Hsp)是一类重要的分子伴侣，按相对分子质量大小分为小热休克蛋白(small heat shock protein，sHsp)、Hsp40、Hsp60、Hsp70、Hsp90和Hsp110，其中Hsp70参与了机体的各种生命活动，包括人的神经退行性疾病、动物病毒病、动物肺炎链球菌感染、动物中毒性疾病等。

热休克蛋白70(heat shock protein 70，Hsp70)家族是一类高度保守的蛋白，属于应激反应性蛋白，在自身免疫性疾病中发挥重要的功能，在机体内主要起到协同免疫的作用，也是生物细胞中含量最多的一种热激蛋白，高度保守且可诱导，通常因生物体温度的变化而被激活。目前，对于Hsp70家族的功能研究主要集中在细胞对有害环境的耐受保护、细胞免疫、先天免疫反应、抗氧化、抗细胞凋亡等，同时Hsp70也参与和调控蛋白质的折叠修饰。

赭曲霉毒素(ochratoxin)主要是由青霉属和曲霉属微生物产生的次级代谢真菌毒素。在A、B、C、D四种类型中，赭曲霉毒素A(OTA)污染最重，分布最广，主要存在与小麦、玉米、大麦、燕麦、黑麦、大米和黍类等作物中，动物摄入了霉变的饲料后，这种毒素也可能出现在猪和母鸡等的肉中。猪采食了含OTA的饲料后会引起严重的肾脏损伤，大量的毒素也可能引起肠黏膜炎症和坏死，还在动物试验中观察到它的致畸作用，对怀孕母猪产生巨大损害。伏马菌素(Fumonisin B，FB)是一种霉菌毒素，是由串珠镰刀菌(Fusarium moniliformeSheld)产生的水溶性代谢产物，是一类由不同的多氢醇和丙三羧酸组成的结构类似的双酯化合物，广泛存在于玉米及玉米制品中，可引起猪的肾损伤和肺水肿，严重危害人畜健康，成为粮食行业和畜牧业防治的重点。

目前，养殖业中的饲料或饲料原料中霉菌毒素污染是非常严重的，霉菌毒素的感染是不能被随时监测的，而且它的感染也具有一定的隐蔽性，达到一定量之后被动物采食很有可能引起动物机体的损伤，内脏受损，严重者造成死亡，对养殖业经济效益造成巨大影响。尽管有各种去霉剂，但并不能保证能够百分之百去除霉菌毒素；另外不同的霉菌毒素需要不同的去霉剂，使用之前需要确定霉菌毒素的种类，对于大量的饲料或原料，检测起来还是比较费时费力的，因此过程比较繁琐。