[发明专利]一种完整外泌体分离、纯化试剂盒及检测分析方法

权利要求书

1.一种完整外泌体分离、纯化试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

免疫磁球，用于从体液中捕获外泌体，形成特异性结合体；

洗脱液，用于将所述特异性结合体分离，形成纯化的外泌体；

洗涤液，用于对经过分离的所述外泌体进行洗涤。

2.根据权利要求1所述的一种完整外泌体分离、纯化试剂盒，其特征在于：所述免疫磁球的制备过程如下：

S1：将1,2-二油酰基磷脂酰胆碱、胆固醇、羧甲基壳聚糖十六烷基季胺盐和Fe₃O₄纳米颗粒共溶解在氯仿中，获得第一组合物；

S2：在步骤S1中的所述第一组合物中加入蒸馏水，得到第二组合物，使用探头式超声仪对所述第二组合物进行超声振荡，然后蒸发得到免疫磁珠溶液；

S3：将二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵溶解在无水乙醇中，同时加入溶酶体相关膜蛋白3抗体，共孵育得到第三组合物；

S4：在步骤S3中的所述第三组合物中加入步骤S2中的所述免疫磁珠溶液，反应后获得免疫磁球溶液；

S5：用磁分离架将步骤S4中的所述免疫磁球分开并清洗，以去除多余的游离抗体，然后将所述免疫磁球放置在磷酸缓冲盐溶液中，并在0～4℃储存。

3.根据权利要求2所述的一种完整外泌体分离、纯化试剂盒，其特征在于：步骤S1中1,2-二油酰基磷脂酰胆碱、胆固醇、羧甲基壳聚糖十六烷基季胺盐和Fe₃O₄的体积比为2:2:1:2。

4.根据权利要求2所述的一种完整外泌体分离、纯化试剂盒，其特征在于：步骤S2中探头式超声仪每次超声振荡为1s，间隔为2s，总时间振荡为6分钟；步骤S2中二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵与溶酶体相关膜蛋白3的质量比为500:3。

5.根据权利要求2所述的一种完整外泌体分离、纯化试剂盒，其特征在于：步骤S4中反应时间为22～26h；步骤S4中加入所述免疫磁珠溶液后，按照原始物质的体积质量比：胆固醇：二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵为1:1。

6.根据权利要求2所述的一种完整外泌体分离、纯化试剂盒，其特征在于：步骤S5中所述磁分离架为磁场强度大于2500Gs的永久磁体。

7.根据权利要求1所述的一种完整外泌体分离、纯化试剂盒，其特征在于：所述免疫磁珠的粒径为10nm～10μm；所述免疫磁珠包括带有以下表面包被抗体：CD9、CD63、CD81、CD44、CD31、Rab5b、EpCAM、TSG101、HSP90、HSP70、ANXA5、FLOT1、ICAM1、ALIX、GM130、ICAM-1、SNAP、MHCI/II、HLA-G、Integrins、Claudins、Tim4，且所述抗体包括单克隆抗体或多克隆抗体。

8.一种根据权利要求1～7任一项所述的完整外泌体分离、纯化试剂盒在血浆、血清、尿液、乳汁、脑脊液、肿瘤腹水、唾液、细胞培养上清中分离外泌体的应用。

9.一种完整外泌体分离、纯化试剂盒的检测分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)向免疫磁珠-外泌体复合物重悬液中加入洗脱液混匀，得到消化组合物；其中免疫磁珠-外泌体复合物与洗脱液的配比为50:1～10～1；

(2)将所述消化组合物置于温度范围20℃至40℃进行消化反应，持续时间1～10分钟，得到第一分离组合物；

(3)向所述第一分离组合物内添加等量于洗脱液加入量的洗脱液抑制剂并混合均匀，得到第二分离组合物；

(4)对所述第二分离组合物进行磁分离，所得上清部分即为外泌体溶液。

10.根据权利要求9所述的一种完整外泌体分离、纯化试剂盒的检测分析方法，其特征在于：所述洗脱液有效成分为胰蛋白酶，所述洗脱液中还包括溶解有胰蛋白酶的不含二价金属离子的水溶液；所述胰蛋白酶包括猪胰蛋白酶、牛胰蛋白酶、羊胰蛋白酶和基因工程表达的胰蛋白酶中的一种或多种。