[发明专利]特异性识别阪崎肠杆菌的纳米抗体及其应用

说明书

本发明提供了特异性识别阪崎肠杆菌的纳米抗体及其应用，属于分子生物学领域和免疫分析技术领域。所述纳米抗体具有依次如SEQ ID No.1～SEQ ID No.3所示的3个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3。所述纳米抗体稳定性强、表达速度快、产量高、特异性好，与金黄色葡萄球菌没有交叉反应；使用所述纳米抗体建立的噬菌体介导的双纳米抗体夹心酶联免疫分析方法的检测灵敏度为5.08×10supgt;4/supgt;CFU/mL；可以解决现有的检测方法特异性差、成本较高的问题，使噬菌体介导的双纳米抗体夹心的酶联免疫分析方法得到更广泛应用。

技术领域

本发明属于分子生物学领域和免疫分析技术领域，具体涉及特异性识别阪崎肠杆菌的纳米抗体及其应用。

背景技术

阪崎肠杆菌是一种重要的食源性病原体，于婴幼儿而言，容易引起败血症、脑膜炎等，并且会导致神经系统的后遗症甚至迅速死亡；于成年人而言，感染阪崎肠杆菌会引发脓血症、菌血症以及局部感染，它的感染会导致较高的发病率和死亡率。据统计，因阪崎肠杆菌感染而导致死亡的概率高达50％。奶粉是感染阪崎肠杆菌的主要渠道，多发于婴幼儿，由于奶粉等大多数食品生产过程繁琐，每个环节都可能发生微生物污染，所以需要在食品生产、加工、分配等所有环节中进行微生物的监测，确保食品安全性。

阪崎肠杆菌的检测方法主要有传统微生物检测方法、分子学检测方法和免疫学检测方法。传统的微生物检测方法准确性和特异性不高，容易导致结果假阳性和假阴性。分子学检测方法包括单一PCR检测、多重PCR检测、荧光定量PCR检测和LAMP等温核酸扩增。由于阪琦肠杆菌遗传的复杂性，普通的PCR鉴定也会存在一些假阳性，假阴性等问题，多重PCR检测方法可以大大降低单一PCR的假阳性或假阴性几率。LAMP等温核酸扩增检测方法的灵敏度很高，能达到9.1fg/μL，但由于其对检测成本、操作技术和引物设计的要求较高(需要设计添加4-6条引物)，增加了引物设计的难度，多对引物的设计还会增加引物二聚体产生的风险，容易出现假阳性，因此应用LAMP检测方法还具有极大的局限性。免疫学检测方法是基于抗原抗体的特异性反应对食品微生物进行鉴定，以阪崎肠杆菌的检测为例，制备阪崎肠杆菌的特异性抗体，通过抗体与抗原的特异性结合实现阪崎肠杆菌的检测。抗体作为免疫分析方法中的核心元件，对抗原的特异性识别以及检测方法的灵敏度起着关键作用。目前的阪崎肠杆菌免疫检测方法主要基于多克隆抗体和单克隆抗体，传统的抗体制备技术往往需要大量动物，制备周期长，产量低，成本高。所以需要建立一种比传统方法速度更快、更方便、更灵敏的检测方法。

纳米抗体作为一种缺乏轻链只含有重链的抗体，分子量只有17kDa左右，是常规抗体的十分之一，是目前已知的和抗原结合的最小单位。纳米抗体具有生产成本低、体积小、稳定性好、免疫原性弱、组织渗透性强、表达产量高、纯化简单等优势。而目前还未见有与抗阪崎肠杆菌的纳米抗体相关的报道。

发明内容

阪崎肠杆菌单克隆抗体或多克隆抗体均存在稳定性差、容易和金黄色葡萄球菌的表面蛋白结合的缺陷，本发明针对现有技术的缺陷和技术领域空白区提供了一种特异性识别阪崎肠杆菌的纳米抗体，并将该纳米抗体应用于检测阪崎肠杆菌的试剂盒中。

为了实现上述目的，本发明提供的特异性识别阪崎肠杆菌的纳米抗体的可变区具有3个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，其中，CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

优选的，所述纳米抗体还包括框架区FR1、FR2、FR3、FR4，四个框架区的氨基酸序列依次如SEQ ID No.4～SEQ ID No.7所示。

优选的，所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.8所示。

优选的，所述纳米抗体是采用噬菌体展示法从所述纳米抗体的基因文库中筛选获得。所述基因文库的容量为1×10⁷CFU/mL，插入率达100％。