[发明专利]用于核酸检测的微流控芯片及检测方法

权利要求书

1.新冠病毒核酸检测方法，其特征在于，利用微流控芯片进行核酸检测；所述方法为非疾病诊断和治疗目的；

包括以下步骤：

（1）向微流控芯片的气道II中通入气体，使得微阀④打开，微阀①、②、③关闭；

（2）向微流控芯片的丫字形流道的一个进样口中通入待测液体样本，另一个进样口中通入LAMP扩增反应液，两种液体流向LAMP反应室；

（3）将微流控芯片置于60-65℃保温30~60分钟，得到LAMP反应产物；

（4）向微流控芯片的气道I中通入气体，使得微阀④关闭，微阀①、②、③打开；

（5）向微流控芯片的分支流道③的进样口中通入双蒸水或缓冲液，使LAMP反应产物进入CRISPR反应室，同时向分支流道②的进样口中通入CRISPR反应液，流向CRISPR反应室；

（6）将微流控芯片置于37℃保持5~10分钟，分析所得的反应产物；

所述CRISPR反应液包含反应缓冲液、Cas12a蛋白、RNase抑制剂、crRNA和ssDNA，其中ssDNA为淬灭的荧光探针；

crRNA：GAAUUUCUACUGUUGUAGAU-GUAGCAGCAAGAUUAGCAGAAGCU

ssDNA：6-FAM-TTATT-BHQ1

所述LAMP扩增反应液包含LAMP Master预混液，一对外部引物F3和B3、一对内部引物FIP和BIP以及两个环导引物LF和LB；

引物序列如下：

F3: 5′-TGTGAAGTTCTTTTCTTGTGC-3′

B3: 5′-GACTTCAAAGTTTGCAGACA-3′

FIP: 5′-GCTATCATCTTATGTCCTTCCCTCA-CATAAGTCACATGCAAGAAGA-3′

BIP: 5′-ACACTCTGACATTTTAGTAGCAGC-GTGACTCAACAATTAATTAGAGC-3′

LF: 5′-AAGATTAGCAGAAGCTCTGATT-3′

LB: 5′-GTCAGCACCTCATGGTGTAG-3′；

所述微流控芯片包括依次叠放在一起并相互密封的三层结构，由上至下分别为气道层、中间层和流道层；

所述气道层包含两个独立的气道，分别为气道I、气道II；其中，气道I呈1字形，与流道层上微阀④的位置相对应；气道II呈T字形，T字形的一边与流道层上微阀①和微阀②的位置相对应；T字形的另一边与流道层上微阀③的位置相对应；气道I的两端分别设有进气口和出气口，气道II包含三个端口，其中一个端口为封闭状态，另两个端口分别为进气口和出气口；且两个气道的端口不重合；

所述中间层为弹性薄膜，用于控制流道层上微阀的开启和关闭；

所述流道层包含四个进样口，两个出样口，四个微阀，一个LAMP反应室、一个CRISPR反应室以及若干条流道；

其中，所述流道层由左至右分别为丫字形流道、LAMP反应室和CRISPR反应室，两个反应室之间通过流道①连通，丫字形流道的一端与LAMP反应室连通，另两端的端口分别为两个进样口；

流道①包含一条与流道①呈T字交叉垂直设置的分支流道②，分支流道②的末端为进样口；

丫字形流道与LAMP反应室连通的一边上设有一条分支流道③，分支流道③的末端为进样口；且分支流道③与分支流道②平行排布；

分支流道②上设有微阀①，分支流道③上设有微阀②，且微阀①与微阀②之间的连线与流道①平行；流道①上设有微阀③，且微阀③位于LAMP反应室与流道①的分支点之间；丫字形流道与LAMP反应室连通的一边上设有微阀④，且微阀④位于丫字形流道的分叉点与丫字形流道的分支点之间；

微阀④通过弹性薄膜与气道层的气道I相连；微阀①、②和③通过弹性薄膜与气道层的气道II相连；

LAMP反应室和CRISPR反应室上各设有一个出样口，或者出样口位于反应室外侧并通过流道分别与各反应室连通。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，用于制作气道层、流道层的材料为聚二甲基硅氧烷。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤（6）将所述微流控芯片置于荧光检测平台，通过检测荧光信号来检测样本中的核酸。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，样本为病毒的DNA或RNA。