[发明专利]重组TET酶MBD4-NgTET1及其在提高TET酶氧化产物中5caC占比的应用

权利要求书

1.一种重组TET酶MBD4-NgTET1，其特征在于：所述重组TET酶MBD4-NgTET1为序列如SEQID No.4所示的重组蛋白结构域MBD4通过GGGS连接肽连接序列如SEQ ID No.5所示的NgTET1蛋白。

2.权利要求1所述的重组TET酶MBD4-NgTET1在制备基于TET酶氧化反应的DNA甲基化检测试剂中的应用，其中所述重组TET酶MBD4-NgTET1催化5mC，生成氧化产物5hmC、5fC及5caC，所述重组TET酶MBD4-NgTET1相较于SEQ ID No .5所示的 NgTET1蛋白提高了TET酶氧化产物中5caC的占比。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于其步骤包括：

（1）采用权利要求1所述的重组TET酶MBD4-NgTET1对模板DNA进行氧化反应；

（2）还原剂处理，碱中和；

（3）DNA回收，回收产物构成全基因组DNA甲基化检测文库；

其中步骤（1）中添加TET酶反应缓冲液，所述TET酶反应缓冲液含有：1-100 mM 3-(N-吗啉基)丙磺酸钠盐、1-100 mM双(2-羟乙基)氨基-三(羟甲基)甲烷、1-100 mM羟乙基哌嗪乙硫磺酸、1-300 mM氯化钠、0.1-10 mM抗坏血酸、0.1-10 mM柠檬酸、0.1-20 mMα-酮戊二酸、0.1-20 mM 1,3-丙酮二羧酸、0.1-20 mM三磷酸腺苷、0.1-10 mM四氟对苯醌、0.1-10 mM四氯对苯醌、 0.1-10 mM四溴对苯醌、0.1-10 mM四碘苯醌、0.01-2 mM三(2-羧乙基)膦、0.01-2 mM二硫苏糖醇。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述TET酶反应缓冲液还含有0.1-50 mM的铁盐化合物。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：步骤（1）中所述的氧化反应的反应温度为10-40℃。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：步骤（1）中所述的氧化反应的反应时间为0.5-2 h。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：步骤（2）中所述的还原剂包括氢化铝锂、氢化硼锂、醋酸硼氢化钠、氰基硼氢化钠、二异丁基氢化铝、三乙基硼氢化锂、氨硼烷、吡啶硼烷、2-甲基吡啶硼烷、硼氢化钠、氨硼烷锂、吡咯烷并硼氢化锂、硼烷乙二胺、硼烷二甲胺、硼烷吗啉络合物、硼烷三苯基膦、硼烷二苯基膦、硼烷三乙胺、4-甲基吗啉硼烷、硼烷三甲胺络合物、5-乙基-2-甲基吡啶硼烷、N,N-二异丙基乙胺硼烷、硼烷四氢呋喃络合物、硼烷二甲基硫醚络合物中的一种或多种。

8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：步骤（2）中还原剂的处理浓度为100-2000mM。

9.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：步骤（2）中还原剂的处理温度为20-50℃。

10.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：步骤（2）中还原剂的处理时间为2-24 h。

11.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：步骤（2）中所述的碱中和使用的是氢氧化钠或氢氧化钾，在反应体系中的终浓度为0.5-1.5 M。

12.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：步骤（3）中所述的DNA回收方式指磁珠法回收、柱法回收或抽提沉淀法回收。