[发明专利]基于CRISPR-Cas反式切割和gFET核酸检测

说明书

本发明公开了一种基于CRISPR‑Cas13a/Cas12a反式切割和石墨烯场效应晶体管的核酸检测方法，将Cas13a/Cas12a固定在石墨烯表面后或者在溶液中与靶向不同病毒核酸的crRNA结合，构建Cas13a/Cas12a‑crRNA复合物，用于快速切割修饰在gFET上的ssRNA/ssDNA，进而引发转移特性曲线的变化，实现对多种病毒核酸的响应。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，特别是涉及一种基于CRISPR-Cas13a/Cas12a反式切割和石墨烯场效应晶体管的核酸检测方法。

背景技术

针对病毒感染及疾病诊断，快速灵敏的核酸检测技术十分关键。目前，RT-qPCR是核酸检测的金标准，该方法可实现高灵敏、高特异的疾病诊断。但是，RT-qPCR的检测过程需要专业人员进行多步的样品处理和控温设备进行多个周期的反应，限制了RT-qPCR在现场检测中的应用。

近年来，CRISPR-Cas系统由于其多样性和Cas蛋白特殊的核酸酶活性，在生物传感器的开发中展现出巨大的潜力。其中，Cas12a和Cas13a具有独特的反式切割活性，近年来被广泛地应用于生物传感领域。目前，基于Cas12a/Cas13a的高灵敏核酸检测方式主要依赖于核酸等温扩增技术，但存在反应系统复杂、检测时间长以及样品易污染等问题。因此，亟待开发一种无扩增、高灵敏的单分子检测方式。

石墨烯具有比表面积大、无悬挂键、载流子浓度和载流子迁移率高、能带结构易于调节等特点，使其表面易于感知微小的电荷变化。石墨烯场效应晶体管(gFET)传感器是以石墨烯为沟道材料制作的场效应晶体管器件，待检DNA与固定于石墨烯表面的互补DNA杂交实现核酸检测，但其检测灵敏度仍有待进一步提高。

发明内容

为解决上述问题，本发明了提供一种基于CRISPR-Cas13a/Cas12a反式切割和石墨烯场效应晶体管的核酸检测方法，Cas13a/Cas12a或游离于溶液中，或通过不同长度的PEG链固定于石墨烯表面，不同长度的PEG可以为Cas蛋白的剪切活动提供适当的空间。当目标核酸激活Cas13a/Cas12a后，Cas13a/Cas12a可以快速切割固定于石墨烯表面的ssRNA/ssDNA，每秒钟发生上千次的切割，导致gFET中源极和漏极之间电流发生快速改变，转移特性曲线发生移动，实现目标核酸的超灵敏检测。其中，将Cas13a/Cas12a固定于石墨烯表面，免去了蛋白扩散到石墨烯表面的时间，使其更接近剪切目标，实现更快速更灵敏的核酸检测。

一方面，本申请提供了一种核酸检测方式，其使用场效应晶体管放大溶液中CRISPR-Cas13a/Cas12a反式切割的信号(如图1)。

进一步地，所述方法包括场效应晶体管的制备步骤、报告分子修饰步骤以及核酸检测步骤。

进一步地，所述场效应晶体管的制备步骤包括：定制商业化gFET芯片，经引线后，构建聚二甲基硅氧烷(PDMS)微流控腔室，将微流控腔室用环氧树脂胶固定于芯片上，并将进液和出液管道插入腔室，用胶封保证腔室密闭，出液管另一端与泵相连，用于液体的抽吸。

进一步地，报告分子修饰步骤包括将PBASE溶液在石墨烯通道表面孵育1-2h、将氨基修饰的ssRNA或ssDNA溶液在石墨烯表面孵育2-12h，以及可选的用乙醇胺进行封闭1h。

进一步地，PBASE溶液浓度为1-3mM；和/或氨基修饰的ssRNA或ssDNA溶液浓度为1-5μM；和/或乙醇胺溶液浓度为100-500mM；

进一步地，所述ssRNA或ssDNA的长度为10-30nt的随机序列。

进一步地，所述PBASE溶液溶剂为乙醇或DMF。

进一步地，所述核酸检测步骤包括将Cas12a或Cas13a与crRNA形成复合物，将检测样本与复合物混合后添加到场效应晶体管中，反应后记录转移特性曲线的变化。