[发明专利]一种用于提取或检测样本中小分子RNA的核酸组合物及其试剂盒和方法

说明书

本发明公开了一种用于提取或检测样本中小分子RNA的核酸组合物及其试剂盒和方法，涉及核酸检测技术领域，该核酸组合物包括固相载体、捕获探针和封闭探针，所述固相载体上固定有单链寡核苷酸；所述捕获探针包括有与所述单链寡核苷酸反向互补的序列以及与靶基因反向互补的序列；所述封闭探针能够与所述捕获探针或其部分反向互补。该核酸组合物在无需提取总RNA的情况下，能够对样本中微量的目标小分子RNA进行捕获分离并进行测序文库构建，其产物可直接应用于高通量测序检测，具有快速、灵敏、高效的优点，可高通量地实现多种小分子RNA的精准检测。

技术领域

本发明涉及核酸检测技术领域，具体而言，涉及一种用于提取或检测样本中小分子RNA的核酸组合物及其试剂盒和方法。

背景技术

大量研究表明，健康人与癌症患者血液中的循环游离核酸(cfNA)，作为一种新型无创诊断生物标志物，具有临床应用价值。

小分子RNA(Small RNA)是一类高度保守的长度小于50nt的RNA分子，是一大类功能各异的调控分子，主要包括：微小RNA(microRNA)、小干扰RNA(siRNA)、piwi蛋白相互作用RNA(piRNA)、重复相关siRNA(rasiRNA)等。它们分别在转录水平、转录后水平及表观遗传水平等方面控制基因的表达，通过多种多样的作用途径，包括mRNA降解、翻译抑制、异染色质形成以及DNA去除，广泛参与调控生物体的生长发育和疾病发生。

MicroRNAs(miRNAs)是小分子RNA中研究较多的一个类型，由19～22个核苷酸组成，通过靶向结合的信使RNA(mRNA)来调控基因表达，具有高度保守性、时序性和组织特异性。研究发现，miRNA不仅存在于细胞内，也存在于细胞外，以细胞外游离形式存在于血液(血浆或血清)和其他类型的生物液体中，如乳汁、尿液或房水等。miRNA通过形成蛋白质复合物或包裹于微囊泡内的形式，免受RNA酶的降解，从而在体液中稳定存在，并发挥细胞间通信及调节受体生物学过程的功能。越来越多的研究发现miRNA与癌症发展有关，癌症组织的miRNA表达谱发生显著改变。而血清和血浆中，含有大量来自各种组织或器官的稳定的miRNA，检测癌症或其他疾病患者的循环游离miRNA，有望成为新型无创诊断方式。

目前，小分子RNA的检测方法主要有Northern印迹分析，微点阵(microarray)分析和实时定量PCR(Quantitative Real-Time PCR)。

Northern印迹是基于杂交检测RNA的常用方法，其缺点在于：不适用于大规模的筛选实验，不能有效区分具有细微序列差异的小分子RNA，且检测过程耗时、样本量消耗大，一次检测需要3个工作日，需要5-10μg的总RNA才能成功检出，不适用于血浆等来源的微量小分子RNA的检测；微点阵分析采用高密度的荧光标记探针与RNA样本杂交，通过荧光扫描获得表达图。

微点阵可以实现高通量的RNA分析，但仍需要较大RNA初始样本量，并且同样无法清楚区分近似小分子RNA。

实时定量PCR技术，是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测，实现目标小分子RNA的定性定量分析。实时定量PCR检测灵敏度高、成本低，常用于RNA表达谱的结果鉴定，其缺点在于无法实现对多种RNA的高通量检测。

因此，需要发展一种小分子RNA检测技术，能够兼顾检测灵敏度、检测通量与检测特异性。

此外，由于生物样本组成的复杂性，现有的RNA检测方法，大多需要先进行总RNA提取，大大增加了检测周期与人力成本，并且在RNA的提纯过程中，也存在RNA降解与靶基因损失风险。

因此，开发一种稳定快捷，可以直接从生物样本中提取小分子RNA，并能够高通量检测的技术，对小分子RNA的临床应用具有重要意义。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容