[发明专利]一种紫心甘薯花色素苷合成调控因子IbEIN3-2及其应用

说明书

本发明公开了一种紫心甘薯花色素苷合成调控因子IbEIN3‑2及其应用。本发明以紫心甘薯品系“A5”为实验材料，克隆了IbMYB1的启动子序列，通过酵母单杂交文库筛选实验，获得了IbMYB1基因的上游调控因子IbEIN3‑2。运用酵母单杂交回转实验和双荧光素酶报告系统检测证实，IbMYB1启动子与上游调控因子IbEIN3‑2之间存在相互作用。本发明在理论上可以丰富和深化植物花色素苷生物合成分子调控的基础理论，还可望为提高紫心甘薯块根中色素含量的栽培措施提供新的思路和线索。

技术领域

本发明涉及植物遗传与变异的分子机制领域，具体涉及一种紫心甘薯花色素苷合成调控因子IbEIN3-2及其应用。

背景技术

甘薯是一年生或多年生的旋花科甘薯属根茎类草本植物，是全球最重要的粮食作物之一，它已经在100多个国家栽植。我国的甘薯种植面积达660万公顷，产量为1亿吨，占世界甘薯总产量的70％。

花青素相关的结构基因的表达主要受到IbMYB1基因启动子的调控。已有学者研究发现IbMYB1受到光、激素等环境因子的调控，但由于甘薯块根是深埋于地下的不见光部分。IbMYB1启动子可能受到其它还未发现的基因对它的调控，从而参与花青素的合成途径。研究发现，在心里美萝卜中，RsMYB1启动子上游存在7372bp的CACTA类型转座子，其在心里美萝卜肉色形成中发挥重要作用，同时高度甲基化的转座子扩散到RsMYB1启动子区域，使该基因的表达受到抑制，阻断花青苷的合成，形成白肉突变体。在玉米中，MYB1启动子和PL1蛋白相互作用，能够使果皮和淀粉层合成花青素。在荔枝中，LcbHLH1和LcbHLH3蛋白分别与LcMYB1启动子相互作用，调节花色素苷生物合成结构基因DFR和ANS的表达,进而促进花色素苷的生物合成。由此可见，MYB1启动子通过与某些蛋白相互作用，调控花青素的合成，因此寻找MYB1启动子在花青素合成途径中的互作蛋白具有重大意义。

转录因子MYB、bHLH(Basic helix-loop-helix)和WD40参与调控植物花色素苷合成。MYB常与bHLH和WD40蛋白形成“MBW”蛋白三元复合体其作用，通过形成复合体共同促进下游花色素苷合成途径关键结构基因表达，从而促进花色素苷合成。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于筛选紫心甘薯IbMYB1表达的上游调控因子。

为了解决上述技术问题，本发明首先用Trizol法从甘薯块根提取RNA，用SMART技术逆转录合成双链的cDNA，构建紫心甘薯酵母单杂交cDNA文库。

进一步的，以紫心甘薯块根DNA为模板，用TaKaRa高保真酶Max DNAPolymerase扩增两端带有不同酶切位点末端的IbMYB1的启动子DNA片段，并将启动子IbMYB1构建到pAbAi载体中，扩增IbMYB1的启动子DNA片段的PCR引物对的具体序列如下所示：

PIbMYB1-F：5'-TATTGCTCTCAATGTGCAAGAATCA-3'和

PIbMYB1-R：5'-TTTGATACGCATACCTTATGCCTAA-3'。

构建的pAbAi-PIbMYB1诱饵载体经过自激活检测后，确定其自激活AbA最低抑制浓度为300ng/mL。

本发明其次将诱饵菌株制成Y1HGold感受态细胞，把文库质粒转入pAbAi-PIbMYB1感受态细胞中，通过酵母单杂交筛库对结合蛋白进行筛选，筛选得到了紫心甘薯IbMYB1基因表达的上游调控因子为IbEIN3-2。

因此，本发明的第一个目的是提供一种紫心甘薯花色素苷合成调控因子IbEIN3-2，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第二个目的是提供一种上述的紫心甘薯花色素苷合成调控因子IbEIN3-2的编码基因，该编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。