[发明专利]用于单细胞识别的细菌耐药性快速检测微流控芯片、制备及应用

权利要求书

1.用于单细胞识别的细菌耐药性快速检测微流控芯片，其特征在于：所述微流控芯片上的微结构包括注菌区（3）、注药区（7）和反应区（5）；

所述反应区（5）包含相互独立且成一列排布的若干个微米尺度的反应孔，每个反应孔两侧分别连接注菌通道（4）和注药通道（6）；

所述注药区（7）包含若干个与所述反应孔一一对应的注药孔，所述注药孔的个数与反应孔的个数相同，所述注药孔之间相互独立且成一列排布，所述注药孔与反应孔通过所述注药通道（6）连通；

所述注菌区（3）包含一个注菌孔，所述注菌孔中的菌液通过注菌通道（4）经多级分流一次性分别注入所有反应孔中。

2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述反应孔和注药孔的个数均为16个；所述注菌孔中的菌液通过注菌通道（4）经四级分流一次性分别注入到16个所述反应孔中。

3.根据权利要求1或2所述的微流控芯片，其特征在于：所述注菌通道（4）包含多级分流弯道，所述分流弯道采用平滑弧直角弯道。

4.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述微流控芯片的基材选用聚二甲基硅氧烷和玻璃的杂化材料，采用等离子键合法制得；具体制备包括以下步骤：

（1）用SU-8光刻法刻蚀出含微流控芯片微结构的母板；

（2）配制聚二甲基硅氧烷混合溶液：将聚二甲基硅氧烷与固化剂以10：1的质量比例混合，通过搅拌使其充分混合，置于真空干燥箱中通过抽真空除去混合溶液中的气泡；

（3）将聚二甲基硅氧烷混合溶液倒在准备好的母板上，再次置于真空干燥箱中抽出气泡后放入60 ℃干燥箱中至少4 h使其完全固化，固化后取出后打孔，形成PDMS微结构层，备用；

（4）芯片键合，将固化后的准备好的PDMS微结构层与玻璃片分别置于等离子清洗仪中，起辉后处理20 s，处理后1分钟内将PDMS微结构层与玻璃片迅速贴合，并置于60 ℃干燥箱中加热10分钟，使键合更充分。

5.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述微流控芯片的基材选用PC，采用真空热压法健合封片制得；具体制备包括以下步骤：

（1）选用满足耐药性检测芯片的实验需求的耐低温、高温的无色透明PC；

（2）用精雕机加工微流控芯片微结构，用0.2 mm超细微粒钨钢铣刀雕刻而成。

6.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述微流控芯片中药物预置，即将药物采用冻干预置的方法植入反应区，具体操作为：将药物分别通过注药孔注入后进入反应区并冻干粘附于反应孔底部，冻干温度在-40~-60 ℃。

7.利用权利要求1所述的微流控芯片进行细菌耐药性检测的方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤一、根据细菌的耐药检测需求，使用显微注射微泵将配置好的药物通过注药孔注入微流控芯片，准确控制注入量，使药物完全进入反应区；使用冷冻干燥器冻干微流控芯片，使药物预置在反应区内，真空包装备用；

步骤二、稀释待测细菌使其浓度为1×10⁴个/ml，使用微量移液器将其注入微流控芯片中，并进入反应区与药物接触；

步骤三、将微流控芯片置于显微镜下，每隔5-10 min采集反应区内的细菌生长状态图片并计数细菌个数，根据菌种需求在适宜环境培养并追踪采集30 min-2 h；以时间为横坐标，以细菌个数为纵坐标，绘制30 min-2 h内细菌数量的变化曲线，分析细菌耐药性。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述细菌为大肠埃希菌，选用的药物及其对应浓度分别为：氨苄西林32 μg/ml、头孢唑啉 8 μg/ml、庆大霉素16 μg/ml、阿米卡星64μg/ml、环丙沙星4 μg/ml、左氧氟沙星8μg/ml、头孢曲松64 μg/ml、头孢吡肟16μg/ml、哌拉西林128 μg/ml、厄他培南8 μg/ml、亚胺培南4μg/ml、头孢呋辛32 μg/ml、氨曲南64 μg/ml、头孢他啶16μg/ml、复方磺胺甲噁唑16 μg/ml。

9.根据权利要求1所述的微流控芯片在细菌耐药性检测中的应用。