[发明专利]一种转座酶活性测定方法

说明书

本发明涉及一种转座酶活性测定方法，尤其是Tn5转座酶活性测定方法，包括：将转座酶与含有转座酶识别序列的底物结合，进行打断反应，将上述打断后的产物进行qPCR检测，根据Ct值评价转座酶的活性。本发明的方法可以对转座酶的活性进行较为精确的测定，从而评价转座酶的活性，并且本发明的方法所需的测活时间短。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种转座酶活性测定方法。

背景技术

目前高通量测序技术的建库过程，根据打断方式的不同可以分为两种方法，分别为物理法和酶法，物理法包括雾化和超声打断DNA，酶法包括DNA片段化酶(Fragmentase)、DNA剪切酶(Shearase)和转座酶(Tn5 Transposase)等，除转座酶外，其他的所有建库方法都包含打断DNA，修复DNA片段和DNA片段加接头几个步骤。使用转座酶建库时，超高活性Tn5转座酶能够对DNA分子进行非特异性的随机切割，仅一步就可以完成打断DNA和DNA片段加接头的过程，使建库反应在2个小时内完成。与传统的机械法片段化DNA相比较，Tn5转座酶处理样品的通量更大、流程更为简便、更节约时间。另外传统的超声机械打断仪价格昂贵，Tn5转座酶处理样本更节约成本。因此可替代传统的超声机械法，应用于高通量测序中的DNA文库构建。

根据Tn5转座酶法进行DNA片段化，将繁琐的DNA片段化、末端修复和接头连接反应等步骤变为一步简单的酶促反应这一特点，建库技术得到了很大的进步，进一步拓展了NGS的适用范围，同时在分子诊断、表观遗传领域也衍生出许多新技术，产生更加广泛、更加多元化的应用。例如：长片段读取、单细胞微量建库、ATAC-seq、CUTTag等。

目前，针对转座酶的测活方法，已有一些文献和专利报道。例如一些报道中，酶活定量测定方法通过转位反应/转化实验，采用阳性菌斑计数的方法测定。使用转座酶和报告基因构建成转座复合体，同时将报告基因导入质粒中，将构建的含有报告基因的质粒转化进入到大肠杆菌细胞中，通过检测细菌(或显色细菌)在抗性平板上的菌斑数量来间接检测转座酶的活性。通过阳性菌斑计数的方法测定转座酶活性，该方法涉及的大肠杆菌转化实验本身的稳定性和重复性较差，转化的效率与感受态细胞的稳定性和效价密切相关，同时转化产生的菌落往往无法精确计数，因此该方法更适合于定性分析而不适合定量分析转座酶的活性；并且实验涉及到细菌培养，整体测活反应时间较长。

CN108265101A公开了一种快速稳定的Tn5转座酶酶活测定方法，使用一种易于检测的Tn5转座酶底物，当Tn5转座酶和测活底物混合后，Tn5转座酶识别测活底物序列中的末端序列，进而催化转座反应，将底物DNA切断，释放带有标记的DNA片段。未反应的底物可以通过能够识别底物标记的介质，经过介质吸附和介质移除的方式去除。通过检测被释放的DNA片段的含量，同标准数据比对，来计算出Tn5转座酶的酶活。

目前针对转座酶活性测定和功能评价之间，缺乏统一的标准和科学的方法，使得Tn5转座酶的生产中，不同批次间酶活测定和比较难以控制。本发明目的在于提供一种稳定、快速测定转座酶活性的方法，能够检测并控制转座酶生产批次间差异，表征转座酶的稳定性，助力更加高标准、高质量的单细胞/分子级的产品开发。

发明内容

本发明提供了一种转座酶活性测定方法，所述方法包括：

(1)将转座酶与含有转座酶识别序列的底物结合，进行打断反应；

(2)将上述打断后的产物进行qPCR检测，根据Ct值评价转座酶的活性。

在一些实施方案中，所述测定方法还包含构建含有转座酶识别序列的底物的步骤。

本发明还提供了一种转座酶活性检测试剂盒，试剂盒包含：含有转座酶识别序列的底物、检测引物。

在一些实施方案中，所述转座酶可选自Tn5、MuA、IS5、IS91或哈氏弧菌转座酶，或其活性突变体。

在一些实施方案中，所述的转座酶是Tn5转座酶。