[发明专利]一种人工修饰3D光交联探针及钓取中草药活性小分子合成酶的方法

说明书

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种利用人工修饰3D光交联探针，在纳米微球表面修饰引发剂，加入单体，通过原子转移自由基聚合反应(ATRP)在纳米微球上合成不同数量的、有一定长度的链，从而形成3D结构，能够增加小分子的固定位点，从而增强钓取蛋白靶点的成功率，更加准确地确定靶标蛋白。进一步连接光交联官能团，使之能与活性小分子连接，用于钓取中草药活性小分子合成酶。本发明可以实现在复杂的蛋白背景中，鉴别中草药活性小分子未知的蛋白靶点，为最终实现中药活性分子的微生物合成奠定坚实的基础。

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种利用人工修饰3D材料及智能钓取中草药活性小分子合成酶的方法。

背景技术

中药来源的小分子很多具有良好而独特的活性，一直是药物开发的重要源泉之一。传统获取植物天然产物的方法是植物提取，这种传统的生产模式有较多缺点，如在宿主中含量比较低且差异大，植物本身生长周期长，且这一方式严重依赖于植物资源的获取和消耗。在化学合成方面，存在着合成路线长、总产率低和经济性差等问题，而且在化学合成中所用的有机试剂容易造成污染，某些反应还需要昂贵的重金属催化剂等，难以实现产业化。

通过合成生物学技术，在微生物细胞中快速高效地获得珍稀植物的稀有活性成分，为植物源天然产物的研究和开发、降低药物的生产成本以及植物资源的可持续利用和发展，开辟了一条全新而高效的途径。合成生物学的成功应用必须基于对天然产物生物合成途径的深入了解。相比微生物，由于基因组庞大，生物合成基因簇通常不连锁等原因，导致植物来源天然产物的生物合成解析非常困难，一些具有重大商业价值的著名分子，如紫杉醇、青蒿素等的合成途径至今还未被完全解析。其主要原因在于缺少行之有效的发现催化活性天然产物中独特结构单元形成反应的新型酶的方法。因此发展一套行之有效的全新的策略来定位植物中合成天然产物的酶，具有很大的研究意义。

药物靶标是指体内具有药效功能并能被药物作用的生物大分子，绝大多数为蛋白。包括多种受体、酶等。小分子和其作用靶标之间存在相互作用，这一特性被广泛地应用于鉴定小分子蛋白靶点。传统的化学生物学的方法鉴定蛋白的靶点，主要策略是通过小分子化学衍生，将其通过化学键共价偶联到特定的基质上，由于小分子与蛋白靶标的相互作用，蛋白靶点会在固定小分子的基质上得到富集。但是这种单一位点的衍生，往往会造成化合物的活性消失，从而造成靶点鉴定实验的失败。酶与小分子底物或产物的相互作用是动态的，而且完全未知的酶与小分子作用模式也完全未知，如果用定点位置衍生的小分子底物或产物的策略，成功获取催化反应的酶的概率会相对较低。

有文献报道，日本理化研究所的Osada及其合作者在高分子填料上固定高反应活性的双吖丙啶基团，在365nm的紫外光的照射下，其产生的卡宾能够近乎随机的插入O/N/S-H和C-H键和临近的小分子结构相连接，这样小分子会以各种不同的方向固定在填料上，方便蛋白靶点的鉴定。通过构建基于卡宾光交联技术的小分子阵列，Osada等人利用荧光强度的方法检测了Biotin、Rapamycin等多个小分子与其靶标或抗体的特异性结合。但小分子往往固定在一个二维(2D)的材料表面，可能会由于拥挤的表面，而造成蛋白鉴定的失败。

表面化学的发展为上述问题的解决提供了新的思路。三维表面化学在近些年为生物分子相互作用的检测芯片提供了丰富的改进空间。三维表面化学,如葡聚糖表面化学、水凝胶表面化学、表面引发聚合表面化学等技术，在为小分子的固定提供大量固定位点并拓展相互作用检测空间的同时,也在很大程度上提高了表面对分析物的抗非特异性吸附能力。其中，原子转移自由基聚合反应(ATRP)是以简单的有机卤化物为引发剂、过渡金属配合物为卤原子载体，通过氧化还原反应，在活性种与休眠种之间建立可逆的动态平衡，从而实现了对聚合反应的控制。

最近有文献报道，约翰霍普金斯大学刘钧教授课题组，利用ATRP聚合反应，合成了一个高通量筛选的小分子微阵列，并比较了2D和新开发的3D表面在相同条件下结合FKBP12的能力，结果表明FKBP12在3D表面上结合的信号背景比，比2D表面上的大6倍，表明新开发的3D芯片是筛选目标蛋白的绝佳平台。并用此3D微阵列发现一种有效的葡萄糖转运蛋白抑制剂RgA。