[发明专利]耐碱蛋白A变体及其应用

说明书

本发明公开了蛋白A变体，尤其是具有高耐碱性以及高IgG结合亲和力的蛋白A变体。本发明还公开了该蛋白A变体的应用。

技术领域

本发明涉及蛋白A变体，尤其是具有高耐碱性的蛋白A变体。本发明还涉及该蛋白A变体的应用。

背景技术

近年来，抗体药物发展迅速。2020年，全球销售额前10位的药物中有一半是抗体药物。抗体药物生产工艺中的纯化步骤通常采用经典的三步或两步层析法。金黄色葡萄球菌蛋白A是上世纪70年代发现的能与多物种抗体Fc端进行结合的菌体蛋白，自发现以来就一直作为重要的抗体纯化层析配体进行研究，目前也是商业化较完善、应用较为广泛的亲和配基。研究发现，蛋白A配基上多个区域对抗体Fc段独特的专一吸附能力，可用作抗体的特异性捕获，一步工艺即可去除细胞发酵液中大部分的杂质，可达98％以上的纯度。随着抗体药物的发展，用作抗体捕获的亲和层析介质也取得了快速发展。

亲和层析介质的选择与产品的质量息息相关。例如早期蛋白A(Protein A)亲和层析配基脱落严重，不易清洗，若这些工艺相关杂质不能在后续工艺中很好地去除，则存在引起免疫反应的风险，进而对药品质量提出很大挑战。因此，外国填料生产商很早就开始致力于增加介质的配基稳定性、结合载量和碱耐受性。例如目前主流蛋白A亲和层析介质如Cytiva公司的MabSelect SuRe，为耐碱层析介质，可耐0.1-0.5M NaOH清洗，从而高效、低成本地除去附着在填料上的蛋白沉淀物、疏水性蛋白、核酸、内毒素和病毒等。配基稳定性也得到了增强，配基脱落100ppm。动态结合载量达到30g/L以上。目前国内抗体药物生产企业大都采用进口蛋白A亲和层析介质。而这些进口蛋白A亲和层析介质通常价格昂贵，约占抗体药物下游纯化工艺中层析介质总成本的85％，并且存在各种可改进的不足之处。例如，MabSelect SuRe的基架微球为高交联的琼脂糖，优点是亲水性极佳，生物相容性好，非常适合抗体类生物大分子的分离纯化；但缺点是：其一，结构偏软，粒径分布较宽，在实际使用过程中存在装柱重复性差，机械强度低等问题；其二，Mabselect Sure在生物制药中一般使用0.1M NaOH清洗，其耐碱性能还有差距；其三，MabSelect Sure的动态载量30g/L，对于大规模高表达量抗体生产所需的载量还有一定差距。又如，Millipore公司的Prosep UltraPlus也是一种使用较为广泛的蛋白A亲和层析介质，基质为孔道可控的玻璃珠结构，物理稳定好，载量很高。但是，玻璃珠结构有一致命缺陷，即不可耐受高浓度NaOH清洗，因而限制其在大规模生物样品中应用。

正因为进口填料昂贵的价格以及各种不足，因此有必要开发国产高效低成本的蛋白A亲和填料。

发明内容

一方面，本文提供了耐碱蛋白A变体，其包括

1)SEQ ID NO：1-3、5-10中任一个所示的氨基酸序列；或

2)与SEQ ID NO：1-3、5-10中任一个所示的氨基酸序列有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述耐碱蛋白A变体与IgG分子结合的KD值不高于不高于1×10^-6M，优选不高于1×10^-7M，更优选不高于3×10^-8M。

在一些实施方案中，所述IgG分子为IgG1分子。

在一些实施方案中，所述耐碱蛋白A变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：1、3或10所示。

另一方面，本文提供了包括上述耐碱蛋白A变体的融合蛋白。

在一些实施方案中，所述融合蛋白包括串联连接的2个、3个、4个、5个或更多个所述的耐碱蛋白A变体。

另一方面，本文提供了上述耐碱蛋白A变体或融合蛋白的核酸分子。

在一些实施方案中，所述核酸分子包括SEQ ID NO：11-13、15-20中任一个所示的核苷酸序列。