[发明专利]无血清全悬浮培养型F81细胞系及其构建方法与应用

说明书

本发明属于生物技术领域，公开了无血清全悬浮培养型F81细胞系及其构建方法与应用。该猫肾悬浮细胞系，名称为猫肾细胞F81悬浮细胞，于2021年11月4日保藏于位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2021289，目前已传至65代，形态以大小均一、透亮圆形为主；病毒敏感性试验显示，该无血清全悬浮培养型F81细胞系对猫细小病毒敏感；该细胞系可用于培养、分离、检测病毒，制备病毒疫苗，筛选用于预防或治疗病毒感染所致的疾病的药物。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及无血清全悬浮培养型F81细胞系及其构建方法与应用。

背景技术

猫泛白细胞减少症(Feline panleukopenia，FPL)又叫猫瘟，是由食肉动物细小病毒1型(Carnivore protoparvovirus1)引起的一种具有高度传染性的疾病，典型症状为泛白细胞减少、严重的肠炎和免疫抑制，具有较高的发病率和死亡率。目前为止猫瘟仍未找到理想的治疗药物，疫苗接种仍是当今防止疫病发生和流行的最有效手段。

随着宠物行业的不断发展，宠物饲养数量逐年增多，以宠物猫和宠物狗为主，在宠物带给人们快乐的同时，宠物健康问题也威胁着公共安全。目前危害宠物猫的病毒主要有猫细小病毒，犬细小病毒，猫冠状病毒，猫疱疹病毒等，而对宠物猫产生严重危害的病毒就是猫细小病毒。增殖猫细小病毒，常用细胞为猫肾细胞(F81)，该细胞具有培养容易、增殖快、猫细小病毒感染效率高猫的特点，是国内外公认的最适合猫细小病毒培养的细胞系。其通常是以贴壁培养生长，细胞之间互相衔接或呈镶嵌状排列，并会在表面集合形成紧密的连接蛋白，从而形成单层贴壁细胞。但是，该培养方式存在一些缺陷，比如贴壁培养受基质表面积限制导致病毒产量下降；贴壁培养过程中换液等程序较为复杂繁琐，血清的使用易受微生物、病毒和支原体等的污染，无血清培养技术是阐明细胞生成、增殖、分化以及基因表达调控的基础问题的有效工具，但即使无血清贴壁培养也只适用于试验研究，不适用于大规模培养，不能满足病毒疫苗等实际生产需要。

细胞无血清全悬浮培养技术已日趋成熟，也是未来生物制品生产大趋势，目前国内已有多株生产用工程悬浮细胞系。但是目前尚不存在无血清全悬浮培养型F81细胞系。

发明内容

本发明第一方面的目的，在于提供一种无血清全悬浮培养型F81细胞系。

本发明第二方面的目的，在于提供第一方面的无血清全悬浮培养型F81细胞系的构建方法。

本发明第三方面的目的，在于提供第一方面的无血清全悬浮培养型F81细胞系的应用。

本发明第四方面的目的，在于提供一种培养病毒的方法。

本发明第五方面的目的，在于提供一种病毒疫苗的制备方法。

本发明第六方面的目的，在于提供一种病毒疫苗。

为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供一种无血清全悬浮培养型F81细胞系，名称为猫肾细胞F81悬浮细胞，于2021年11月4日保藏于位于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2021289。

本发明的第二个方面，提供本发明第一方面的无血清全悬浮培养型F81细胞系的构建方法，包括如下步骤：1)对贴壁培养型F81细胞进行低血清驯化，得到低血清贴壁型F81细胞系；2)对低血清贴壁型F81细胞系进行全悬浮无血清驯化，得到无血清全悬浮培养型F81细胞系。

优选地，步骤1)中所述低血清驯化包括如下步骤：依次将贴壁培养型F81细胞接种至含9.5～10.5％、5.5～6.5％、3.5～4.5％、1.5～2.5％胎牛血清的MEM培养基中进行传代培养。

进一步优选地，不同浓度的胎牛血清的MEM培养基中培养3～10代。