[发明专利]一种用于检测大口黑鲈虹彩病毒的实时荧光RAA引物、探针及试剂盒

说明书

本发明涉及水生动物病毒核酸检测技术领域，公开了一种用于检测大口黑鲈虹彩病毒的实时荧光RAA引物、探针及试剂盒。本发明根据大口黑鲈虹彩病毒MCP基因序列设计得到实时荧光光RAA引物和探针；本发明提供的试剂盒包含上述引物和探针；本试剂盒的引物的终浓度为400nmol/μL，探针的终浓度为120nmol/μL；本试剂盒还包含BufferⅠ，BufferⅡ，酶混合液，阳性对照品和阴性对照品。本发明采用实时荧光RAA方法检测大口黑鲈虹彩病毒的引物、探针、试剂盒，检测快速、操作简便；特异性好，敏感度高；适用于养殖场现场快速检测。

技术领域

本发明属于病毒核酸检测技术领域，具体涉及一种通过实时荧光重组酶聚合酶恒温扩增技术(RAA)来快速检测大口黑鲈虹彩病毒的引物、探针以及试剂盒。

背景技术

大口黑鲈(Micropterus salmoides)俗称加州鲈，隶属硬骨鱼纲(Osteichthyes)、辐鳍鱼亚纲(Actinopterygii)鲈形目(Perciformes)、太阳鱼科(Cehtrachidae)黑鲈属(Micro pterus)，是一种优质淡水鱼类，具有适应性强、生长快、易捕捞、养殖周期短等优点，加之肉质鲜美细嫩，无肌间刺，外形美观，深受养殖者和消费者欢迎^[1]。大口黑鲈属中高档淡水养殖品种，单位经济效益显著。近十多年来，我国的大口黑鲈养殖产业获得了飞速发展，其养殖产量以年均9％以上的速度增长，根据中国渔业统计年鉴2020的数据，全国加州鲈产量约为47.8万吨，产值过百亿。随着养殖规模的扩大，养殖密度的增加，水体环境的恶化，大口黑鲈的病害问题也越来越突出，造成巨大经济损失，也严重制约了该产业的持续发展。大口黑鲈的病毒性疾病死亡率高，且难以防治，给世界范围内的大口黑鲈养殖业造成了严重的威胁，其中以虹彩病毒蛙病毒属的大口黑鲈虹彩病毒(Largemouth bassranavirus，LMBV)感染引起的大口黑鲈虹彩病毒病(Largemouth bass ranavirusdisease，LMBVD)危害和影响最大，国内报道的大口黑鲈病毒性溃疡病也是由这种蛙病毒感染所致。近年来，LMBV在我国大口黑鲈主养区域的流行和危害呈明显上升趋势，对我国大口黑鲈养殖业造成了巨大的威胁和严重的经济损失。

目前，LMBV的检测和鉴定主要采用各种核酸扩增方法，为了提高病毒检测的灵敏性和精确计算各感染组织中病毒拷贝数，研究人员开发出了针对LMBV的各种荧光定量PCR技术。Pallister等人建了可用于检测和区分LMBV欧洲和澳大利亚株型的实时荧光定量PCR方法。Goldberg等人和Getchell等人分别描述了一种使用不同引物检测LMBV的TaqMan实时PCR方法。与传统的细胞培养方法相比，该方法在检测感染细胞和患病鱼组织器官中LMBV的灵敏度要高出100倍。Pallister等人建了可用于检测和区分LMBV欧洲和澳大利亚株型的实时荧光定量PCR方法。马冬梅等人根据LBUSV的DNA甲基转移酶基因序列设计引物和探针，通过LBUSV的Taq Man MGB探针荧光定量PCR检测方法。李江宇等人基于MCP基因和TaqMan探针建立了蛙病毒属三重荧光PCR检测方法。虽然这些常规PCR和定量PCR方法具有灵敏度高的优点，但缺乏直接测定PCR产物的简便方法，限制了其在现场检测中的应用。LAMP检测方法不需要昂贵的设备和复杂的程序，可能是现场诊断LMBV的最佳检测系统，其灵敏度是常规PCR方法的十倍以上，整个检测过程可在35分钟内完成，有望成为监测和早期诊断大口黑鲈传染性皮肤溃疡综合征的有力工具。Zhu等基于LMBV的MCP基因保守区域设计了4条引物，建立了灵敏度高、特异性好的LAMP检测方法，对LMBV的DNA检测最低灵敏度可达到85拷贝/μL，不需要特殊的仪器设备，可用于养殖场中LMBV感染情况的早期检测。但LAMP检测需要4～6条引物，且与传统PCR相比，设计难度大，还非常容易出现假阳性结果。因此，急需一种准确度高、操作简单、便于携带和使用的其它方法进行LMBV的现场检测。