[发明专利]一种测定包含氨基酸的肌肽中肌肽含量的方法

说明书

本发明提供了一种测量肌肽中的L‑组氨酸和β‑丙氨酸的含量的方法，包括配制待测样品和氨基酸标准品以及肌肽的标准品；使用高效液相色谱法，以无机和有机溶液的混合液为流动相，使用外标法来计算所述待测样品中肌肽以及氨基酸的含量。本发明所提供的测量方法可以很好的实现肌肽、L‑组氨酸、β‑丙氨酸的基线分离，测定含量准确，回收率高，检测限低。

技术领域

本发明涉及检测领域，具体涉及一种测定包含氨基酸的肌肽中肌肽含量的方法。

背景技术

1900年，俄国学者Gulewitsch最早发现了肌肽。他从Liebig的肉提取物中分离了肌肽，后来被证实这种物质的结构为β-丙氨酰-L-组氨酸。这是从天然原料中分离得到的第一个具有代表性的生物活性肽。

L-肌肽(β-丙氨酰-L-组氨酸)及其类似物(如高肌肽和鹅肌肽)，广泛存在于机体组织的细胞内，在肌肉和中枢神经系统表达最高，在脊椎动物骨骼中，肌肽的含量约为1.6～20.6μmol/g，在猪肉、牛肉和鸡肉中的含量分别为4.8、2.0和15.0mmol，在人体肌肉中的含量为2～20mmol。随着对肌肽的深入研究，学者们纷纷研究了肌肽的生物学特性。迄今为止，L-肌肽的许多生物学活性已被证实，如生理pH缓冲作用、螯合金属离子、清除自由基、抗氧化、防止蛋白质糖化、抗衰老、抗炎以及抗肿瘤等。由于其抗氧化的活性强，毒副作用低并具有多种生理活性，肌肽及其衍生物在医药、保健、卫生、化妆品等领域已有广泛的应用，市场空间广阔。

目前L-肌肽的生产主要采用化学合成法。已有的化学合成方法比较多，例如，利用β-丙氨酸经氨基保护、羧基活化后与保护的L-组氨酸缩合，然后脱掉保护基团得到L-肌肽；L-组氨酸先与不同的β-丙氨酸前体生成肽键，再进一步转换为肌肽；采用氨肽酶催化β-丙氨酸甲酯与L-组氨酸一步合成L-肌肽(申请公布号为CN107217048A的专利文献)等。在各种合成方法中，不可避免的会导致L-肌肽反应料液中残存未反应的L-组氨酸和β-丙氨酸，或者合成的L-肌肽经过酶的降解又分解为L-组氨酸和β-丙氨酸，严重影响了最终L-肌肽的得率和纯度。

现有文献对肌肽和氨基酸的分离报道极少，文献报道其他氨基酸、氨基酸与多肽之间的分离主要采用离子交换法，将混合溶液除酸或中和至pH降至氨基酸、多肽的等电点以下后除盐，再用阳离子交换树脂吸附其中绝大部分碱性氨基酸和部分中性氨基酸，利用梯度洗脱，分别得到单一的氨基酸和多肽。但由于组氨酸的等电点为7.6，肌肽的等电点为7.0，两者的等电点非常接近，导致交叉洗脱较为严重，肌肽的纯度低、收率低，大大降低了整个工艺过程的分离效果。文献CN202010513278.4中公开了一种肌肽和组氨酸的分离方法，色谱柱采用C18，流动相采用癸烷磺酸钠缓冲溶液(取癸烷磺酸钠1.22g、磷酸氢二钾11.41g溶于1000mL去离子水中，并以磷酸溶液调节PH至3.0即得)：乙腈＝78：22(v/v)；流速为1.0mL/min，检测器为紫外检测器，波长为215nm。但流动相配制方法繁琐，且癸烷磺酸钠有一定的毒性，对实验操作者及环境具有一定的危害，此外没有涉及同时检测L-组氨酸和β-丙氨酸的方法。

因此需要一种简单、快捷、准确度高的检测方法可同时测定L-肌肽、L-组氨酸和β-丙氨酸的含量，从而为提高肌肽的纯度提供数据支持。

发明内容

针对现有技术存在的L-肌肽、L-组氨酸和β-丙氨酸检测方法缺失，本发明提供了一种L-肌肽、L-组氨酸和丙氨酸同时检出的高效液相色谱检测方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

1.一种测定包含氨基酸的肌肽中肌肽含量的方法，其包括：

配制待测样品和氨基酸标准品以及肌肽的标准品；

使用高效液相色谱法，以无机和有机溶液的混合液为流动相，使用外标法来计算所述待测样品中肌肽以及氨基酸的含量。

2.根据项1所述的方法，其中，所述氨基酸包括L-组氨酸和β-丙氨酸，所述肌肽为L-肌肽。