[发明专利]一种2,4-滴的即用型免疫传感器

说明书

本发明涉及一种2，4‑滴的即用型免疫传感器，在获得2，4‑滴模拟表位多肽后，将多肽与纳米荧光素酶分裂后的大片段融合表达，将纳米荧光素酶分裂后的小片段与2，4‑滴纳米抗体融合表达，通过优化融合蛋白中的连接臂长度及多肽拷贝数，选择具有较好信噪比和响应值组合用于2，4‑滴的检测，融合蛋白中的多肽和纳米抗体的结合，使得LgN和SmN重建形成具有催化发光活性的纳米荧光素酶，从而显著增强体系的发光强度，而2，4‑滴会将多肽与纳米抗体的结合解离，使得体系的发光强度降低，本发明实现了对小分子的免标记、免固定、免洗涤的检测，具有快速、简便、经济、实用性强、灵敏度高的优势。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种2，4-滴的即用型免疫传感器。

背景技术

一些小分子化合物(如农药、毒素、有机污染物等)通常与食品安全、环境污染等社会普遍关注的议题相关。因此，建立针对小分子的快速检测方法，对提供及时的预警和监测具有十分重要的意义。在小分子快速检测技术中，基于抗原和抗体特异性识别的免疫检测得到了广泛的认可和应用。但免疫检测中的特异性识别和信号产生需要独立的试剂，这就使得试剂之间的标记、固定或者洗涤步骤不可避免，不仅增加了检测试剂的生产周期和检测时间，还会导致批次间差异和检测误差。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于重组试剂的免标记、免合成、免洗涤的即用型免疫传感器，其制备方法和检测方法。

为实现上述目的，本发明将2，4-滴模拟表位多肽与纳米荧光素酶分裂后的大片段(LgN)融合表达，获得重组蛋白Pm-LgN，将纳米荧光素酶分裂后的小片段(SmN)与2，4-滴纳米抗体融合表达，获得重组蛋白Sm-VHH，其中，模拟表位多肽和2，4-滴纳米抗体的结合，使得LgN和SmN重建形成具有催化发光活性的纳米荧光素酶，从而显著增强体系的发光强度，而2，4-滴会将多肽与2，4-滴纳米抗体的结合解离，使得体系的发光强度降低。

所述2，4-滴模拟表位多肽，是麦芽糖结合蛋白(MBP)和2，4-滴纳米抗体的融合蛋白为靶标，从噬菌体展示随机十二肽库中，通过三轮亲和淘选获得，其氨基酸序列为AsnGly Phe Phe Glu Phe Trp Gln Val Val Tyr Val，所述2，4-滴纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

所述重组蛋白Pm-LgN的最佳重组形式为，模拟表位多肽以双拷贝的形式串联融合在LgN的N端，且与LgN之间具有一个氨基酸序列为GGGSGGGS的间隔臂，所述重组蛋白Sm-VHH的最佳重组形式为， SmN融合在2，4-滴纳米抗体的N端，且与2，4-滴纳米抗体之间具有一个氨基酸序列为GGGSGGGS的间隔臂。

本发明的目的通过下述技术方案予以实现：

(一)2，4-滴模拟表位多肽的亲和淘选：

第一步：靶标蛋白制备

利用质粒pMAL-p5X作为表达载体，通过酶切位点Not I and EocR I将2，4-滴纳米抗体克隆到MBP 下游，将表达质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株，25℃，终浓度1mM的IPTG，过夜诱导表达MBP与2， 4-滴纳米抗体的融合蛋白，表达结束后，离心收集菌体，使用“渗透休克法”提取细胞周质蛋白，依次使用直链淀粉树脂和镍柱从蛋白提取液中纯化出目的蛋白。

第二步：亲和淘选程序

将纯化后的MBP与2，4-滴纳米抗体的融合蛋白作为靶标蛋白，包被在酶标板上，用5％脱脂奶粉封闭酶标板，将噬菌体展示随机线十二肽库加入包被和封闭后的酶标板中进行亲和淘选，并使用2，4-滴溶液竞争洗脱结合的噬菌体，淘选过程按照“吸附-洗涤-洗脱-扩增”的循环进行，经过3轮的淘选，每轮淘选降低用于竞争洗脱的2，4-滴的含量。

第三步：阳性克隆鉴定