[发明专利]一种采用实时荧光定量PCR技术检测藏羊BMPR-IB基因表达谱的方法

权利要求书

1.一种采用实时荧光定量PCR技术检测藏羊BMPR-IB基因表达谱的方法，其特征在于，具体步骤包括如下：

步骤1，总RNA的提取：利用TRNzol Universal总RNA提取试剂进行总RNA的提取，具体步骤如下：

步骤1.1：取-80℃冻存组织，约50mg组织样，在无RNA酶的培养皿上剪碎，之后将其转入1.5mLEP管中，加入450μL TRNzol Universal试剂，用研磨器快速研磨成细末状，再加入550μL TRNzol Universal试剂，摇匀，得匀浆样品备用；

步骤1.2：将匀浆样品在室温放置4min，使得核酸蛋白复合物完全分解，然后在4℃，12000rpm条件下，离心10min，吸取上清液备用；

步骤1.3：在步骤1.2的上清液中加入200μL氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15s，室温放置3min，然后在4℃，12000rpm条件下，离心15min；把500μL水相溶液转移到新的离心管中；

步骤1.4：将步骤1.3得到的水相溶液中加入等体积的异丙醇，混匀，室温放置10min，然后在4℃，12000rpm条件下，离心10min，弃上清液，沉淀物备用；

步骤1.5：在步骤1.4得到的沉淀物中，加入1mL用RNase-free ddH₂O配制的75％乙醇，洗涤沉淀；然后在4℃，10000rpm条件下，离心5min，倒出液体，注意不要倒出沉淀，剩余的少量液体短暂离心，然后用枪头吸出，室温放置3min晾干，备用；

步骤1.6：在步骤1.5得到物质中，加入30μL RNase-free ddH₂O，反复吹打、混匀，充分溶解RNA；

步骤2，RNA质量检测：取4μL步骤1提取的RNA，加入1μL的6xLoading Buffer上样缓冲液混匀，在浓度为1.0％的琼脂糖凝胶中电泳，并利用Nanodrop测定OD 260/280nm比值及浓度，总RNA样品在-80℃保存，备用；

步骤3，反转录-PCR：利用FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix试剂盒进行反转录，反转录反应体系为20μL：RNA 10μL，5×FastKing-RT Super Mix 4μL，RNase-freeWater 6μL，反应条件为：42℃，15min，95℃，3min；

步骤4，引物设计及实时荧光定量PCR技术：根据GenBank数据库中绵羊BMPR-IB和GAPDH基因的mRNA序列设计引物，BMPR-IB基因的上下游引物分别为：

F：5-CAAGAAGCTGCGGCCCTCCT-3，

R：5-AGGCAGGATTGTGAGCCCAGC-3；

GAPDH的上下游引物分别为：

F：5-GCGAGATCCTGCCAACATCAAGT-3，

R：5-AGGCAGGATTGTGAGCCCAGC-3；

以GAPDH为内参，利用BIORAD CFX96荧光定量PCR仪，分析BMPR-IB基因在藏羊不同组织中的表达量；扩增体系为20μL：10μL 2×SuperReal Color PreMix，0.6μL上游引物(10μM)，0.6μL下游引物(10μM)，2μL cDNA，用ddH₂O补足到20μL；熔解曲线条件为：60～95℃，每隔0.05s读板1次；阴性对照用1μL ddH₂O代替模板，每个样品的检测进行3个独立重复，扩增条件为：95℃预变性15min；94℃变性10s；57℃退火32s；共40个循环；

步骤5，数据分析：采用2^-ΔΔCT方法处理数据，分析基因表达量，其中，ΔCT＝CT_(BMPR-IB)-CT_(GAPDH)，2^-ΔΔCT表示被测基因mRNA的表达相对于GAPDH的倍数，数据统计分析采用SPSS20.0。

2.根据权利要求1所述的一种采用实时荧光定量PCR技术检测藏羊BMPR-IB基因表达谱的方法，其特征在于，所述步骤1中，TRNzol Universal总RNA提取试剂购自北京天根生化有限公司。

3.根据权利要求1所述的一种采用实时荧光定量PCR技术检测藏羊BMPR-IB基因表达谱的方法，其特征在于，所述步骤4中，不同组织为健康成年藏羊个体的卵巢、输卵管、子宫、下丘脑、垂体、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、瘤胃、十二指肠、背最长肌、臂三头肌、股四头肌及半腱肌。