[发明专利]一种同时分离外泌体和细胞核的方法以及一种同时对外泌体和单细胞核测序的方法

权利要求书

1.一种同时分离外泌体和细胞核的方法，包括以下步骤：

1)将待提取的组织和匀浆缓冲液混合匀浆，得到破碎组织；对所述破碎组织进行第一离心，得到第一上清液和第一沉淀；

所述匀浆的浆液温度为0～5℃，所述匀浆的时间≤10s；所述匀浆缓冲液以PBS为基础，还含有浓度为1～2U/μL的RNase抑制剂；

所述第一离心的相对离心力为2000～3000g；

2)对所述第一上清液进行第二离心，得到第二上清液，对所述第二上清液进行第一过滤，得到第一滤液；所述第一滤液中包含外泌体；所述第一过滤的过滤孔径为0.22μm；所述第二离心的相对离心力≥15000g；

3)将所述第一沉淀和裂解缓冲液混合，进行裂解，得到裂解液；

4)采用细胞筛对所述裂解液进行第二过滤，得到第二滤液，对所述第二滤液进行第三离心，得到第三沉淀；所述第三沉淀中包含细胞核；所述第三离心的离心力为800～1000g；

所述步骤2)和步骤3)、步骤2)和步骤4)之间之间没有时间顺序限制。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述第一过滤后还包括：采用exoEasy Maxi Kit试剂盒对所述第一滤液中的外泌体进行纯化。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述的裂解缓冲液包括以下浓度的组分：10mM Tris-HCl、1mM CaCl₂、5mM NaCl、体积浓度为0.1％～0.2％的TritonX-100、体积浓度为0.1％～0.2％的吐温20和0.4U/μLRNA酶抑制剂；所述Tris-HCl的pH值为7.5。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中，所述第二过滤的次数为2次，第一次第二过滤所采用的细胞筛的孔径为40μm，第二次第二过滤所采用的细胞筛的孔径为30μm。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中所述第三离心的时间为10～15min。

6.根据权利要求1、4和5中任意一项所述的方法，其特征在于，步骤4)中，所述第三离心后还包括：重悬所述第三沉淀，采用去碎片试剂对重悬的第三沉淀进行去碎片纯化处理，得到纯化后的细胞核沉淀。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，得到去碎片纯化处理后还包括：采用洗涤缓冲液对得到的细胞核沉淀进行洗涤，所述洗涤包括：将所述去碎片纯化处理得到的细胞核沉淀和洗涤缓冲液混合，第四离心弃上清，得到洁净细胞核沉淀；所述洗涤次数≤5次；所述第四离心的离心力≤500g。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述洗涤次数为2～5次，所述第四离心的离心力为300～500g；所述第四离心的时间为5～10min。

9.一种同时对外泌体和单细胞核测序的方法，包括以下步骤：

采用权利要求1～8任意一项所述方法制备得到外泌体和细胞核沉淀；

对所述细胞核沉淀进行单细胞测序；

提取所述外泌体中的小RNA，对所述小RNA进行建库，进行NGS测序。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，提取所述外泌体中的小RNA采用miRNeasySerum/Plasma Kit试剂盒进行。