[发明专利]转氨酶及其在制备光学纯手性胺中的应用

权利要求书

1.一种转氨酶，其特征在于，所述转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，或所述转氨酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比，具有第65位、第94位、第132位、第300位以及第327位氨基酸突变中的一种或多种，所述突变为氨基酸残基的增加、缺失或取代。

2.如权利要求1所述的转氨酶，其特征在于，所述突变选自下述组：第65位、第94位、第132位、第300位的取代突变和第327位的缺失突变；优选所述突变选自以下组：V65A、L94C、S132H和D300A。

3.如权利要求2所述的转氨酶，其特征在于，所述转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

4.一种核酸分子，其多核苷酸序列选自：

(1)编码权利要求1-3中任一项所述的转氨酶的多核苷酸序列；和

(2)(1)所述多核苷酸序列的互补序列；

优选地，(1)所述的多核苷酸序列如SEQ ID NO:3或如SEQ ID NO:4所示。

5.一种核酸构建体，其含有权利要求4所述的核酸分子；优选地，所述核酸构建体为表达盒。

6.一种重组载体，其含有权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述的核酸构建体；优选地，所述重组载体为重组克隆载体或重组表达载体。

7.一种宿主细胞，其含有权利要求4所述的核酸分子、权利要求5所述的核酸构建体或权利要求6所述的重组载体，和/或，其表达权利要求1-3中任一项所述的转氨酶。

8.一种酶制剂，所述酶制剂含有权利要求1-3中任一项所述的转氨酶。

9.下式I所示的手性胺的制备方法：

其中，所述方法包括，在助溶剂和任选的辅酶的存在下，使用来自节杆菌属(Arthrobacter sp)的转氨酶或与其氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的转氨酶或权利要求1-3中任一项所述的转氨酶或权利要求8所述的酶制剂催化氨基供体与下式III所示的底物反应，从而制备得到式I所示的手性胺：

其中，式I和III中，R₁为卤代苯基，R₂为C_1-4烷基；

优选地，式I化合物为(R)-1-(3-氟苯基)乙胺，式III化合物为3-氟苯乙酮。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述节杆菌属(Arthrobacter sp)的转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的转氨酶为NCBI登陆号为3WWH_A、3WWI_A、5FR9_A或3WWJ_A的转氨酶。

11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，

所述助溶剂选自：二甲亚砜、醇类溶剂和甲苯；和/或，

所述氨基供体选自：芳香胺、脂肪胺和氨基酸；

优选地，所述醇类溶剂为异丙醇，所述芳香胺为R-苯乙胺，所述脂肪胺为碳链长度为2-6个碳原子的脂肪胺如异丙胺或仲丁胺，所述氨基酸为丙氨酸和/或天冬氨酸。

12.如权利要求9所述的方法，其特征在于，

转氨酶的用量为反应体系中底物重量的1-50％，如10-40％或15-30％；优选15-20％；

反应体系中含有辅酶，辅酶的用量为底物重量的0.1-5.0％，如1-3％；优选2-2.5％；所述辅酶优选5-磷酸吡哆醛(PLP)；

反应体系中，氨基供体的用量为底物重量的600％-1240％；

反应体系的pH为6～10，优选为8～10，更优选为8.9～9.1；

反应温度为10℃～50℃，优选为20℃～45℃，更优选为28～35℃；

反应时间为0.1～120小时，例如0.5～48小时、10～24小时或16～92小时。