[发明专利]检测HPV16的试剂、试剂盒及应用

说明书

本发明属于基因检测技术领域，公开了检测HPV16的试剂、试剂盒及应用。该检测HPV16的试剂，可以实现同管一步法稳定、高灵敏地检测HPV16，可检测到个位数的基因拷贝数：无需对RT‑RPA扩增产物实行移液操作，从而去除了移液操作产生的扩增产物气溶胶污染的风险，适合于规模化检测。

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，具体涉及检测HPV16的试剂、试剂盒及应用。

背景技术

宫颈癌是女性常见恶性肿瘤之一，由单一亚型高危型人类乳头瘤病毒(HumanPapilloma virus，简称HPV)持续感染引起的。HPV属于乳多空病毒科的乳头瘤空泡病毒属，是球形DNA病毒，能引起人体皮肤劲膜的鳞状上皮增殖。HPV包括六个早期调控基因(E1、E2、E4、E5、E6、E7)和两个晚期基因(L1、L2)。早期基因参与病毒DNA的复制、转录、翻译和细胞转化等功能，而晚期基因的功能是编码病毒的衣壳蛋白。其中E6、E7两个早期基因分别抑制了肿瘤的抑癌基因P53和Rb而与宫颈癌的发生、发展存在直接关系。HPV按照危险程度可以分为低危型和高危型，高危型易造成宫颈癌。研究表明，99.7％的宫颈癌与高危型HPV感染有关，其中80％的高危型HPV感染为无致癌风险的一过性感染，两年内将自行消退；20％高危型HPV感染为有潜在致癌风险的持续性/整合感染，但只有伴随持续性E6、E7 mRNA转录，产生E6、E7癌蛋白，才会最终致癌。E6、E7 mRNA是目前宫颈癌最佳的风险评估指标。在感染的潜伏期或宫颈癌前病变阶段检测出高危型HPV并采取适当的治疗措施，可以有效地阻断宫颈癌的发生。因此，检测高危型HPV的E6、E7基因的核酸(包括DNA或mRNA)，特别是mRNA的检测，对于宫颈癌的早期防治，具有重要的临床意义。已知的HPV亚型16型和18型两种病毒造成75％以上的宫颈癌病例。

HPV的持续感染是宫颈癌发生的必要条件，通过在宫颈脱落细胞中检测HPV核酸已经成为筛查宫颈癌及癌前病变的重要手段。目前HPV DNA检测技术按照技术原理主要分为杂交法，实时定量PCR法，第二代杂交捕获法，焦磷酸测序法及飞行质谱技术，并且HPV DNA分型检测技术也越发受到关注。以杂交法为基础建立的检测HPV DNA的方法主要有：原位杂交，荧光原位杂交，Southern Blot，微阵列技术，导流杂交基因芯片，荧光探针标记的侧向层析技术和反向点杂交等。以上方法可在一定程度上检测到HPV感染并可应用于分型检测，但是也存在灵敏度较低，步骤多，操作繁琐，费时耗力，需要特殊的仪器设备，检测成本昂贵，通量低，不适合大通量临床样品的筛查等缺点。并且杂交法需要与多重聚合酶链反应相结合，检测分析至少需要两步以上反应所得产物，无疑增加了操作，污染和检测时间。实时定量PCR作为高灵敏度，高准确性和定量的核酸检测技术，在HPV DNA分型定量检测中得到广泛应用，具有操作简单，快速，灵敏度高和可定量等优点，商品化的试剂盒也已经广泛应用于临床检测。然而该方法通量低，成本较高，需要依赖精细温控变化的仪器与专业操作人员等。第二代杂交捕获技术检测是一种将HPV DNA与溶液中标记的RNA探针杂交并利用非同位素信号放大系统进行检测的方法，其扩增的是检测信号，而不是靶片段DNA的量，因此不需要与多重聚合酶链反应结合。但是该方法不能对HPV进行分型，灵敏度与准确度不如结合PCR的方法，并且步骤较多，操作繁琐，耗时长。焦磷酸测序是一项全新的DNA测序技术，可以快速、准确地测定一段较短的目标DNA片段，可用于HPV分型，定量性能好，准确性高，但是该技术需要与巢式PCR结合，操作步骤多，通量较低，检测成本也较高。飞行质谱技术是一种定量检测不同荷质比的技术，具有高灵敏度，高特异性，高通量的优点，但是检测成本昂贵，依赖高尖端质谱仪器，高通量筛查也易造成资源浪费。