[发明专利]一种生产FecB基因g.A746G定点突变绵羊的试剂盒及其方法

权利要求书

1.一种生产FecB基因g.A746G定点突变绵羊的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有FecB-pegRNA的体外转录模板质粒、FecB-sgRNA的体外转录模板质粒以及PE2 mRNA的体外转录模板质粒，以FecB-pegRNA的体外转录模板质粒、FecB-sgRNA的体外转录模板质粒为模板通过PCR扩增得到的FecB-pegRNA体外转录模板序列如SEQ ID No.4所示，FecB-sgRNA体外转录模板序列如SEQ ID No.5所示。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的FecB-pegRNA的体外转录模板质粒是通过以下方法构建得到：

(1)合成靶向FecB基因序第746位碱基的Space、Scaffold、RT-PBS的寡核苷酸序列：

(2)将Space、Scaffold、RT-PBS寡核苷酸链进行退火，分别得到Space退火产物、Scaffold退火产物以及RT-PBS退火产物；

(3)以pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin质粒为模板，使用以下引物进PCR扩增，得到构建体外转录模板质粒的骨架：

F1：AGCTAGGTCTCCTTTTTTTAAAGAATTCTCGACCTCGAGAC

R1：TCTCTCGGTCTCACGGTGTTTCGT

(4)将体外转录模板质粒骨架进行纯化回收，回收产物使用BsaI限制性内切酶酶切后进行纯化回收，与Space退火产物、Scaffold退火产物、RT-PBS退火产物连接；

(5)将连接产物转化至DH5α感受态细胞，将测序结果正确的菌液扩大培养并提取质粒，得到的质粒为FecB-pegRNA体外转录模板质粒；

所述的FecB-sgRNA的体外转录模板质粒是通过以下方法构建得到：

(1)合成位于Space附近sgRNA的寡核苷酸序列：

sgRNA-Up：accgTTCTGTCTCTCGGAACCAGC

sgRNA-Down：aaacGCTGGTTCCGAGAGACAGAA

(2)将sgRNA寡核苷酸链退火，得到sgRNA退火产物；

(3)将pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin使用BsaI限制性内切酶进行线性化，纯化回收线性化的pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin，并将其与sgRNA退火产物连接；

(5)将连接产物转化至DH5α感受态细胞，将测序结果正确的菌液扩大培养并提取质粒，即FecB-sgRNA体外转录模板质粒；

所述的PE2 mRNA的体外转录模板质粒为pCMV-PE2质粒。

3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括用于通过PCR扩增得到FecB-pegRNA体外转录模板序列的引物F2/R2以及用于通过PCR扩增得到FecB-sgRNA体外转录模板序列的引物F3/R3，所述的引物序列如下：

F2：gatccctaatacgactcactataggTCACTACAGAGGAGGCCAGC

R2：AAAAAAAATACAGAGGAGGCCAGCTGGT

F3：atccctaatacgactcactataggTTCTGTCTCTCGGAACCAGC

R3：AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTC。

4.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括用于检测FecB基因g.A746G定点突变绵羊的PCR引物，若PCR扩增产物的第163位碱基为G，则羔羊为FecB基因g.A746G定点突变绵羊；

正向引物F：5’-AGGTCCAGAGGACGATAGCA-3’；

反向引物R：5’-AGGAAACCCTGAACATCGCTAA-3’。

5.权利要求1-4任一项所述的试剂盒在制备利用基因编辑系统Prime Editing生产FecB基因g.A746G定点突变绵羊的受精卵中的用途。