[发明专利]一种表达酯酶EstR的大肠杆菌基因工程菌及其应用

权利要求书

1.一种表达酯酶EstR的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，其是将具有序列如SEQ IDNO.3所示的EstR基因序列的目的片段克隆到表达载体中，获得重组质粒，然后将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中制备获得。

2.如权利要求1所述的表达酯酶EstR的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述表达载体为pET-28a(+)表达载体。

3.一种如权利要求1或2所述的表达酯酶EstR的大肠杆菌基因工程菌的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、提取热链状地芽孢杆菌Geobacillus thermocatenulatus strain BGSC 93A1的基因组DNA；

步骤二、以热链状地芽孢杆菌的EstR序列设计上下游引物，上游引物序列如SEQ IDNO.1所示，下游引物序列如SEQ ID NO.2所示；

步骤三、以步骤一的热链状地芽孢杆菌Geobacillus thermocatenulatus strainBGSC 93A1的基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到目的DNA片段，序列如SEQ ID NO.3所示；

步骤四、将目的DNA片段克隆到pET-28a(+)表达载体，得重组质粒；

步骤五、将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，获得重组菌株。

4.一种含酯酶EstR基因的重组质粒，其特征在于，其是将具有序列如SEQ ID NO.3所示的EstR基因序列的目的片段克隆到表达载体中制备获得。

5.一种酯酶EstR基因，其具有序列如SEQ ID NO.3所示的EstR基因序列。

6.一种如权利要求1或2所述的表达酯酶EstR的大肠杆菌基因工程菌在酶法拆分制备(R)-6-氟-色满-2-羧酸的方法中的应用。

7.一种如权利要求1或2所述的表达酯酶EstR的大肠杆菌基因工程菌用作酶法拆分制备(R)-6-氟-色满-2-羧酸的方法中的催化剂。

8.一种微生物酶法拆分制备(R)-6-氟-色满-2-羧酸的方法，其特征在于，其是以权利要求1或2所述的表达酯酶EstR的大肠杆菌基因工程菌为催化剂，以外消旋6-氟-色满-2-羧酸甲酯为底物，在pH为6.0-8.5的缓冲液中，加入有机溶剂，在20-60℃温度下反应1-12小时，接着，进行分离纯化。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的有机溶剂为异丙醇、丁醇、甲苯、正己烷、正庚烷或异辛烷中的一种。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的分离纯化，其是在反应完成后，采用过滤方法去除表达酯酶EstR的大肠杆菌基因工程菌后，加入5M氢氧化钠溶液调节pH至11-12后，分离有机相和水相，然后在水相中加入盐酸溶液调节pH至1-2，用乙酸乙酯萃取3遍，旋蒸蒸发除去溶剂即可得到(R)-6-氟-色满-2-羧酸白色固体。