[发明专利]一种利用肿瘤患者自体胸、腹水制备水凝胶个性化培养肿瘤类器官的方法

说明书

本发明公开了一种利用肿瘤患者自体胸、腹水制备水凝胶个性化培养肿瘤类器官的方法。本发明提供了一种培养肿瘤患者自体肿瘤类器官的方法，包括：将待培养的来自肿瘤患者的肿瘤细胞与基质混合，使细胞终浓度为(5‑10)×10³/mL；所述基质为离体的去除细胞成分的肿瘤患者自体的体腔积液；添加蛋白交联剂，然后将混合得到的水凝胶溶液加入到细胞培养容器底部，37℃平放静置至凝固；向水凝胶上方加入肿瘤类器官培养液，培养得到肿瘤类器官。该方法具有生物相容性好、避免异源组份污染、培养成本低廉的优点。

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种利用肿瘤患者自体胸、腹水制备水凝胶个性化培养肿瘤类器官的方法。

背景技术

类器官培养是采用三维细胞培养技术，将具有三维结构的支架材料与细胞在体外共同培养，使细胞在三维立体空间结构中迁移、生长并形成三维立体结构。三维细胞培养是介于单层细胞培养与动物实验之间的一种技术，既能最大程度地模拟体内环境，又具有细胞培养的直观性及培养条件可控性等优势。类器官模型在新药研发、干细胞研究以及肿瘤研究等领域具有广泛的应用前景。

合成或天然材料如海藻酸盐、明胶、透明质酸、琼脂糖、层粘连蛋白、胶原蛋白或纤维蛋白等常被用于制备水凝胶支架。合成的凝胶材料虽然重复性好，但与细胞的生物相容性较差，培养成功率低，而动物源性支架材料则含有诸多不确定组份，且可能存在批次间差异，也会影响细胞培养结果的准确性和客观性；最后，动物源性凝胶一般价格都十分昂贵，限制了其广泛应用。因此，发明一种能克服上述缺点的凝胶制备方法对于推动三维细胞培养技术的发展意义重大。

恶性胸、腹水是晚期癌症患者常见并发症。在晚期肺癌中，胸水发生率高达60％，以血性胸水为主，约占75％。腹水则以妇科和消化道肿瘤多见，同样以血性腹水为主。恶性胸、腹水中除含有一定的细胞成分(包括肿瘤细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、红细胞等)和不溶性蛋白及复合物外，其主要成分为可溶性蛋白，蛋白含量约为40mg/ml。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用肿瘤患者自体胸、腹水制备水凝胶个性化培养肿瘤类器官的方法。

在本发明中，自体的含义是：肿瘤细胞和用于培养肿瘤细胞以得到肿瘤类器官所用的水凝胶中的基质(即体腔积液，如胸水腹水)来自于同一个肿瘤患者。

第一方面，本发明要求保护一种培养(体外培养)肿瘤患者自体肿瘤类器官的方法。

本发明要求保护的培养(体外培养)肿瘤患者自体肿瘤类器官的方法，可包括如下步骤：

(A1)将待培养的肿瘤细胞与基质混合，使细胞终浓度为(5-10)×10³/mL(如5×10³/mL)；所述基质为离体的去除细胞成分的肿瘤患者自体的体腔积液；

(A2)向(A1)中添加蛋白交联剂，混合后得到含有肿瘤细胞的水凝胶溶液；

(A3)将所述含有肿瘤细胞的水凝胶溶液加入到细胞培养容器底部，37℃平放静置至所述水凝胶溶液凝固；

(A4)向(A3)的水凝胶上方加入肿瘤类器官培养液，培养得到肿瘤类器官。

其中，所述体腔积液可选自如下任一种或多种：胸水、腹水、盆腔积液、关节腔积液、脑脊液等。

在本发明的具体实施方式中，所述体腔积液为胸水或腹水。

其中，所述蛋白交联剂可选自如下任一种或多种：戊二醛、EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)、SMCC(4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸N-羟基琥珀酰亚胺酯)、DSS(双琥珀酰亚胺辛二酸酯)、DST(双琥珀酰亚胺酒石酸酯)、MBS(m-马来酰亚胺基苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯)、SPDP(琥珀酰亚胺3-(2-吡啶基二硫基)-丙酸酯)。