[发明专利]经修饰的CrRNA片段及非洲猪瘟病毒试剂盒

说明书

本发明公开了一种经修饰的CrRNA片段及非洲猪瘟病毒试剂盒。所述经修饰的CrRNA片段是在CrRNA片段的3’端增加了DNA修饰片段。经修饰的CrRNA片段能够进一步提高CRISPR/DX检测体系的反应速率，从而缩短检测时间。CRISPR/DX检测体系采用独特的双靶配合，将两个针对不同靶点的经修饰的CrRNA配合在一个反应体系当中，可提高整体反应速率。该CRISPR/DX检测体系与RPA扩增体系结合后能够构建CcMFD非洲猪瘟病毒的试剂盒。特别能够提高LBcas12a蛋白的切割效率，并可以提高靶点特异性。

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，特别涉及一种经修饰的CrRNA片段及非洲猪瘟病毒试剂盒。

背景技术

非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起的一种烈性、高度接触性动物传染病，猪一旦感染之后死亡率可达到100％，世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须报告的动物疫病，我国也将非洲猪瘟列为一类动物疫病。非洲猪瘟病毒基因组为双连闭合线性DNA分子，大小约为170–194kb，含有150–160个开放阅读框(ORF)，总共编码54种结构蛋白和100多种非结构蛋白。非洲猪瘟病毒基因组主要由末端的发卡环结构、中间部分是比较稳定的基因区和由串联重复序列和多基因家族构成的可变区三部分组成，其中可变区基因拷贝数的变化是造成基因组大小不等的主要因素。根据编码主要衣壳p72(B646L)基因末端约500bp核苷酸的差异已鉴定出24种基因型，但是基因型不能反映出病毒血清学特性，也不能反映毒株的免疫学特。利用PCR技术对不同病毒基因型进行遗传演化分析发现，西非地区流行的主要是基因Ⅰ型，东非和南非则有20多种基因型。基因II型流行于非洲东南部，2007年传至格鲁吉亚、俄罗斯和东欧地区；2017年该基因型病毒传播至俄罗斯伊尔库茨克地区。目前我国流行的毒株为基因II型，与俄罗斯及东欧流行的毒株属同一分支。

由于目前世界上还没有研发出有效的针对非洲猪瘟病毒的疫苗，为防止疾病传播疫点内的生猪只能被全部扑杀和无害化处理，给养殖业带来巨大经济损失。因此，在当前严峻的防控形势下研发简便、快速、精确的非洲猪瘟病毒现场检测技术就显得非常迫切。

发明内容

本发明目的在于提供一种经修饰的CrRNA片段及非洲猪瘟病毒试剂盒，以解决现有技术中所存在的一个或多个技术问题，提供至少一种有益的选择或创造条件。

本发明的第一目的在于提供一种经修饰的CrRNA片段。在CrRNA片段的3’端具有长度为5~10bp的DNA修饰片段。增加了DNA修饰片段后的CrRNA片段在CRISPR/DX检测体系中能够进一步提高反应速率，从而缩短检测时间。

进一步，所述DNA修饰片段的长度为7bp。具体地，所述DNA修饰片段为5’-TCCCCCC-3’或者5’-TATTATT-3’。在CrRNA片段的3’端增加上述修饰片段后，使用该经修饰的CrRNA片段的CRISPR/DX检测体系后期切割效率相较于使用未添加修饰的CrRNA片段有所提高。

进一步，所述经修饰的CrRNA片段如表1所示的任意一条：

表1 CRISPR/DX检测体系中经过DNA修饰的CrRNA

本发明的第二目的在于提供一种检测体系，所述检测体系包括前述的经过DNA修饰片段后的CrRNA片段。改进后的检测体系的检测效率获得了提高。

进一步，所述检测体系同时使用两段所述经修饰的CrRNA片段，包括第一CrRNA片段和第二CrRNA片段，所述第一CrRNA片段的序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3或SEQ ID NO.4所示，所述第二CrRNA片段的序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.7或SEQ ID NO.8所示。使用两段经修饰的CrRNA片段的检测体系是通过双靶点进行配对，能够进一步加快反应速率，提升检测效率。