[发明专利]抗可替宁特异性抗体、质粒载体及方法

说明书

本发明公开了一种抗可替宁特异性抗体、质粒载体及方法，包括由COT‑KLH偶联物免疫小鼠，分离鼠脾脏淋巴细胞并通过流式细胞仪分选出与该蛋白特异性结合的B淋巴细胞，利用单细胞PCR将B淋巴细胞中的抗体重链及轻链可变区序列扩增出来，将得到的序列构建成完整鼠IgG抗体序列表达载体，通过瞬转HEK293F细胞表达单克隆抗体，纯化单克隆抗体并分别标记胶体金颗粒，通过胶体金竞争法确定优势单抗，对评估受检者环境烟草烟雾暴露程度、吸烟量以及吸烟对人体健康影响程度有重要意义。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域。具体涉及抗可替宁特异性抗体、质粒载体及方法。

背景技术

烟草的使用导致了全球每年数百万人死亡，造成了严重的公共卫生问题。烟草烟气中含有上千种化学物质，其中包含了六十余种已确定或被怀疑对人体具有致癌作用，对这些致癌物暴露及危害进行评价时，常需要取适当生物标志物对烟草延期的摄入量、致癌物摄入量和健康效应等进行评价。尼古丁作为存在于烟草中的一种成瘾性生物碱，短时间内，进入人体的尼古丁经空腔，咽喉，气管及肺泡吸收进入血液循环，其中约80％的尼古丁在肝脏中被细胞色素氧化酶2A6(CYP2A6) 首先代谢为可替宁(COT)，主要存在于血液中，之后再进一步被代谢，最终这些代谢产物会通过尿液等途径排出。因此尿液中的可替宁是评估受检者环境烟草烟雾暴露程度、吸烟量以及吸烟对人体健康影响程度最有效的生物标志物。

虽然液相色谱、高效液相色谱、气相色谱和高效液相色谱联用质谱等方法已用于可替宁的检测，但这些方法需要样品预处理，且成本高、耗时长。免疫检测具有抗体与抗原特异性强、灵敏度高、操作简单、通量大、成本低等优点。以胶体金免疫层析试纸检测方法为代表的免疫检测技术在快速诊断可替宁方面表现得尤为突出，不仅简化了检测步骤，而且提高了检测可替宁的特异性和灵敏度。

因此制备可替宁单克隆抗体成为可替宁特异性检测诊断的主要方式。

发明内容

为了实现上述设计目的。本发明的第一方面，提供了一种抗可替宁特异性抗体，包括轻链和重链，所述轻链的可变区氨基酸序列如 SEQ ID NO.1所示；所述重链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步的，编码如SEQ ID NO.1所示的所述轻链的可变区氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；编码如SEQ ID NO.2所示的所述重链的可变区氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

本发明的第二方面，提供了一种质粒载体，该质粒载体含有如 SEQ ID NO.5所示的轻链可变区核苷酸序列。

本发明的第三方面，提供了一种质粒载体，该质粒载体含有如 SEQ ID NO.6所示的重链可变区核苷酸序列。

本发明的第四方面，提供了一种抗可替宁特异性抗体，包括轻链和重链，所述轻链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述重链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

进一步的，编码如SEQ ID NO.3所示的所述轻链的可变区氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；编码如SEQ ID NO.4所示的所述重链的可变区氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

本发明的第五方面，提供了一种质粒载体，该质粒载体含有如 SEQ ID NO.7所示的轻链可变区核苷酸序列。

本发明的第六方面，提供了一种质粒载体，该质粒载体含有如 SEQ ID NO.8所示的重链可变区核苷酸序列。

本发明的第七方面，提供了一种抗可替宁特异性抗体真核表达质粒载体的方法，包括以下步骤:

a)通过PCR将轻链可变区核苷酸序列和重链可变区核苷酸序列分别与鼠IgG轻链恒定区核苷酸序列和重链恒定区核苷酸序列桥接后酶切，并分别连接质粒载体，构建真核细胞表达载体；