[发明专利]一种热稳定性提高的羧肽酶A突变体

说明书

本发明涉及酶工程技术领域，具体涉及一种热稳定性提高的羧肽酶A突变体，本发明利用计算机辅助设计，对现有牛胰腺羧肽酶A的氨基酸序列(PDB ID：1M4L)进行改造，获得突变体△133‑139。本发明制备的突变体△133‑139具有OTA降解活性，对1μg/mL的OTA降解率为74.8％。与现有羧肽酶A相比，该突变体在45℃时半衰期t_1/2提高40.4min，半失活温度T₅₀¹⁰升高6.7℃，熔融温度T_m升高3.1℃，有效提高了热稳定性，在饲料和食品脱毒领域具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及酶工程技术领域，具体涉及一种热稳定性提高的羧肽酶A突变体的设计和制备方法。

背景技术

赭曲霉毒素A(Ochratoxin A，OTA)是由曲霉属(Aspergillus)和青霉属(Penicillium)等丝状真菌产生的一类次级代谢产物，其结构为苯丙酸异香豆素。OTA常在各种植物和动物源性食品中出现，对人体造成免疫毒性、肝毒性和致癌性等，目前已被国际癌症研究机构(IARC)列为IIB类致癌物。我国作为农业生产大国和消费大国，小麦、玉米、花生等农产品容易被OTA污染，通过食物链各环节对消费者造成严重的食品安全隐患。源于牛胰腺的羧肽酶A(Carboxypeptidase A，CPA，EC 3.4.17.1)是最早发现的OTA降解酶，其背景最为清晰，其对于OTA的降解能力受到广泛认可，在葡萄酒、农产品脱毒方面具有很好的应用前景。

然而，在葡萄酒和农产品的生产加工过程中往往不可避免高温环境，这对于CPA的应用有很大的考验。因此，对CPA进行热稳定性改造能够提高其在高温条件下的催化效率，减少酶使用量。目前，常用的热稳定性改造策略是在酶序列和结构的基础上，通过计算机算法设计突变，该方法能够有效提高改造准确率，减少筛选工作量。

发明内容

制约羧肽酶A工业化应用的主要瓶颈是其热稳定性差，因此，开发具有良好热稳定性的羧肽酶A具有重要意义。本发明提供一种热稳定性提高的羧肽酶A突变体，与野生型相比，本发明的改造酶具有更好的热稳定性，且维持赭曲霉毒素A降解功能，有较大的应用潜力。

为解决现有技术中存在的问题，本发明基于对牛胰腺羧肽酶A(CPA，PDB ID：1M4L)柔性区域的分析，结合氨基酸运动轨迹的均方根方差值(Root mean square fluctuation，RMSD)、均方根涨落值(Root mean square deviation，RMSF)、溶剂可及表面(Solventaccessible surface area，SASA)及回转半径(Radius of gyration，Rg)指标，筛选出热稳定性提高的羧肽酶A突变体。

本发明的目的之一是提供一种热稳定性提高的羧肽酶A突变体。

在本发明的一种实施方式中，所述的羧肽酶A突变体是在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列基础上，将第133位～第139位氨基酸截除，表达含有300个氨基酸的CPA突变体(△133-139)，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明的目的之一是提供所述羧肽酶A突变体的编码基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的目的之一是提供所述羧肽酶A突变体基因的载体。

在本发明的一种实施方式中，所述的羧肽酶A突变体是以pET-28a(+)作为载体。

本发明的目的之一是提供所述羧肽酶A突变体的表达菌株。

在本发明的一种实施方式中，所述的羧肽酶A突变体是在表达菌株E.coli BL21(DE3)。