[发明专利]双标记gFET的制备及其在miRNA检测中的应用

说明书

本申请提供了一种双标记石墨烯场效应晶体管的制备方法及其在miRNA检测中的应用。本申请的双标记石墨烯场效应晶体管中对GFET的表面进行双链特异性核酸酶(DSN)和DNA探针的双标记修饰，将DSN酶固定在GFET表面，使DSN周围铺有DNA探针，同时每个DNA探针都在DSN的空间水解范围内。利用双标记的GFET快速测定miRNA的浓度时，向GFET的反应池中加入待测miRNA，其与DSN附近的DNA结合形成异源互补双链后，DSN可迅速水解DNA探针并释放miRNA，释放的miRNA可再次与其它DNA探针结合并引起DNA探针不断水解，进而引起电信号的变化。

技术领域

本申请属于生物传感器技术领域，具体地，本申请提供了一种双标记石墨烯场效应晶体管的制备及其在miRNA检测中的应用。

背景技术

miRNA调控网络在人体的生长、代谢、免疫防御等一系列的生命过程中起着重要的作用。大多数疾病的发生发展过程中，miRNA表达水平的变化与疾病的诊断、分期、治疗及预后判断等有着密切的联系。此外，miRNA的异常表达还可见于一些感染性疾病、急性组织创伤、免疫紊乱相关疾病等。因此，对miRNA快速、准确的检测在疾病的预防、诊断、治疗及预后判断等方面发挥重要的作用。然而，传统的miRNA检测方法主要为Northern blotting、微阵列分析及qRT-PCR法。其中Northern blotting曾被认为是miRNA检测的金标准方法，然而由于其比较耗时、样品消耗大且灵敏度不高使得其未得到广泛的应用，不能实现对miRNA超敏定量测定。miRNA微阵列技术具有高通量分析的能力，但同时受制于灵敏度低、反应时间长等缺点，也未得到大面积的推广。至于qRT-PCR法，虽然足够灵敏，但存在操作复杂、耗时较长且依赖高昂仪器等缺点，同时由于miRNA的链比较短，因此很难设计引物来区分较为相似的miRNA序列，在miRNA测定中也具有一定的缺陷。因此亟需开发新的miRNA检测方法来满足临床上日益增高的需求。

场效应晶体管(FET)生物传感器是近年来最具潜力的生物传感器之一，因为它在检测样本时具有超灵敏和快速等特点。另外，FET芯片易于微型化和集成化，因此在实际应用方面具有更加广阔的空间。其中石墨烯场效应晶体管(GFET)充分利用了石墨烯的大的比表面积，导电性能好、电子迁移率高、生物兼容性强以及表面易于功能化等特点，使其成为生物传感器的最佳选择。目前，基于GFET的生物传感器在miRNA上的检测报道相对较少，且其特异性对单碱基错配的miRNA区分较低。双链特异性核酸酶(DSN)是一种能高效识别并酶切完全互补配对的DNA/RNA杂交双链中的DNA链，而对单链DNA和单/双链RNA几乎没有作用的核酸酶，且具有催化效率高，对miRNA的高特异性，放大检测信号等优点，在miRNA的检测中应用广泛。因此，将DSN与GFET可以实现miRNA的高特异性、超敏、快速的检测。同时，考虑到游离DSN从溶液中扩散至GFET表面，尤其是在较低浓度时，需要较长时间，因此对GFET进行DSN和DNA探针的双标记，有望实现miRNA更加快速的测定，为疾病的实时监控提供有力技术支撑。

发明内容

针对上述问题，本申请提供了一种双标记石墨烯场效应晶体管的制备方法及并将其应用在miRNA检测中。对GFET的表面进行双链特异性核酸酶(DSN)和DNA探针的双标记修饰，将DSN酶固定在GFET表面。使DSN周围铺有DNA探针，同时每个DNA探针都在DSN的空间水解范围内。利用双标记的GFET快速测定miRNA的浓度时，向GFET的反应池中加入待测miRNA，其与DSN附近的DNA结合形成异源互补双链后，DSN可迅速水解DNA探针并释放miRNA，释放的miRNA可再次与其它DNA探针结合并引起DNA探针不断水解，进而引起电信号的变化，实现miRNA的放大检测(原理如图1所示)。

一种双标记石墨烯场效应晶体管，其特征在于，所述双标记石墨烯场效应晶体管修饰有双链特异性核酸酶和DNA探针；DSN周围铺有DNA探针，个DNA探针均位于DSN的空间水解范围内。

进一步地，所述双标记石墨烯场效应晶体管包括衬底、功能化的单层石墨烯、源/漏极及反应池；单层石墨烯平铺在衬底表面，源/漏极镀在石墨烯表面。