[发明专利]水稻根际土壤非共生固氮菌株的筛选方法及所用培养基

权利要求书

1.水稻土壤非共生固氮菌株选择性培养基，其特征在于：

AVM培养基的配方为：牛肉蛋白提取物3g/L，DL-苹果酸2.5g/L，氢氧化钾2.5g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，氯化钠1.1g/L，磷酸氢二钾1g/L，酵母提取物0.2g/L，硫酸镁0.2g/L，氯化钙0.2g/L，Fe-EDTA 66mg/L，硫酸锰10mg/L，钼酸钠2mg/L，生物素0.2mg/L，氯化铵0.5mg/L，琼脂15g/L，余量为水，pH6.6～7.0。

2.水稻根际土壤非共生固氮菌株的筛选方法，其特征在于包括以下步骤：

1)制备水稻根际土壤非共生固氮菌株选择性培养基，命名为AVM培养基；

2)水稻根际土壤的获取；

3)菌株的分离；

4)菌株的纯化；

5)菌株的DNA提取、PCR分析及鉴定。

3.根据权利要求2所述的水稻根际土壤非共生固氮菌株的筛选方法，其特征在于：还包括步骤6)的乙炔还原活性测定固氮能力。

4.根据权利要求3所述的水稻根际土壤非共生固氮菌株的筛选方法，其特征在于步骤3)为：

将步骤2)所得的水稻根际土壤进行清洗后，再采用释稀法进行菌株的分离：

在1#～7#试管中分别加入10ml的无菌磷酸盐缓冲溶液，向1#试管中加入2.0g清洗后水稻根际土壤均匀混合，取1#试管所得的500ul土壤悬液加入至2#试管内均匀混合，而后依次类推，直至取6#试管所得的500ul土壤悬液加入至7#试管内均匀混合；

对3#～7#试管分别进行如下处理：

先将200ml的AVM培养基熔化后趁热倒入无菌平板中，待凝固后，用无菌吸管吸取200ul水稻根际土壤悬液加入AVM培养基平板中，用涂布棒将土壤悬液均匀涂布在培养皿中并且使其干燥，用封口膜密封每个培养皿，并倒置于32℃的培养箱中放置2～3天。

5.根据权利要求4所述的水稻根际土壤非共生固氮菌株的筛选方法，其特征在于：

所述无菌磷酸盐缓冲溶液为将PBS缓冲液经过2次0.22μm无菌过滤；

所述PBS缓冲液的配方为：NaCl 8g/L，KCl 0.2g/L，KH₂PO₄ 0.27g/L，Na₂HPO₄ 1.44g/L，余量为水。

6.根据权利要求2～5任一所述的水稻根际土壤非共生固氮菌株的筛选方法，其特征在于：

所述步骤4)的菌株的纯化为：

针对步骤3)培养所得的细菌，使用接种针取细菌单个菌落在AVM培养基平板上划线，划线后，用封口膜密封培养皿，在28±0.5℃下密封培养直至获得肉眼可见的完整菌落；得纯化菌株；

将纯化菌株加入LB液体培养基中密封培养18小时后离心，弃上清，取离心所得的底部沉淀物作为菌株种子液；

LB液体培养基的配方为：胰蛋白胨2.5g，酵母提取物1.25g，氯化钠2.5g，水250mL。

7.根据权利要求6所述的水稻根际土壤非共生固氮菌株的筛选方法，其特征是：

所述步骤6)为：

取步骤4)所得的菌株种子液1ml接种到含有100ml AVM培养基的容器中，在30±0.5℃进行旋转摇瓶密封培养，直至生长至指数中期；

取生长至指数中期的菌液1ml接种至含有10mL AVM培养基的容器中，并在30±0.5℃密封培养至指数期；然后，将密封容器顶部空间气体的10％用乙炔代替，并再次于30±0.5℃下密封培养6小时；用气相色谱仪测定生产的乙烯。