[发明专利]甘氨酸核糖开关基因调控线路的构建方法及应用

权利要求书

1.甘氨酸核糖开关基因调控线路的构建方法，其特征是，通过在野生型的甘氨酸核糖开关元件序列上进行突变，从文库高通量筛选出性能提升，甘氨酸响应范围增加和振幅值增加的甘氨酸-ON的突变体和构象改变的甘氨酸-OFF的突变体，从而实现基因的表达调控。

2.如权利要求1所述的构建方法，其特征是，源于枯草芽孢杆菌，核酸序列如SEQ IDNO:4所示；具有与SEQ ID NO:4等同的基因表达调控功能，经过筛选得到的突变体BSglyON3、BSglyON4、BSglyON9、BSglyON10、BSglyON13、BSglyON14表现为甘氨酸响应范围和振幅值增加；突变体BSglyOFF5、BSglyOFF6、BSglyOFF8、BSglyOFF11、BSglyOFF12、BSglyOFF35表现为野生型甘氨酸-ON构象突变为甘氨酸-OFF构象；以上突变体的详细突变位点如下表1：

表1中突变位点信息栏的数字代表突变位点，横杠前的字母表示突变前的核苷酸，横杠后的字母表示突变后的核苷酸。

3.如权利要求1或2所述的构建方法，其特征是，包括如下步骤：

1)：以SEQ ID No.1所示BSGlyRS-F和以SEQ ID No.2所示BSGlyRS-R为引物，以SEQ IDNo.3所示pUC-BSGlyRS为模板，通过PCR的方法，得到以SEQ ID No.4所示BSGlyRS片段；

2)：以SEQ ID No.5所示tetA-F和以SEQ ID No.6所示tetA-R为引物，以SEQ ID No.7所示pUC-TETA为模板，通过PCR的方法，得到以SEQ ID No.8所示tetA片段；

3)：以SEQ ID No.9所示GFP-F和以SEQ ID No.10所示GFP-R为引物，以SEQ ID No.11所示pUC-GFP为模板，通过PCR的方法，得到以SEQ ID No.12所示GFP片段；

4)：以SEQ ID No.13所示pUC18-F和以SEQ ID No.14所示pUC18-R为引物，以SEQ IDNo.15所示pUC18为模板，通过PCR扩增，得到pUC18质粒骨架；通过CEPC组装技术，将与上述步骤1)获得的BSGlyRS、骤2)获得的tetA和骤3)获得的GFP片段连接到pUC18质粒骨架上面，得到质粒命名为pUC18-BSTG，以SEQ ID No.16所示；

5)：以SEQ ID No.17所示BSGT-mutF和以SEQ ID No.18所示BSGT-mutF为引物，以SEQID No.16所示pUC18-BSTG为模板，通过PCR扩增，得到BSGlyRS片段文库；

6)：以SEQ ID No.19所示18-mutF和以SEQ ID No.20所示18-mutF为引物，以SEQ IDNo.16所示pUC18-BSTG为模板，，得到文库质粒载体片段pUC18-STG；获得两者片段构建为甘氨酸核糖开关质粒文库pUC18-BSTGlib，以SEQ ID No.21所示；

7)：将步骤6)中质粒文库转化到大肠杆菌MG1655中，得到转化子收集于2-4mL无菌水中；一半体积的转化子接种于M9培养基中，并补加质量比10-12％镍离子过夜培养；然后转接到新鲜M9培养基中，补加质量比0.4-0.8％的甘氨酸以选择甘氨酸-ON核糖开关，随后在80-100μg/mL氨苄青霉素，质量比0.4-0.8％甘氨酸和10-20μg/mL四环素的新鲜M9培养基中培养进一步富集甘氨酸-ON核糖开关；通过流式荧光细胞分选仪器对具有最高绿色荧光的克隆进行分选；

8)：另一半体积的转化子接种于新鲜M9培养基中，补加与步骤7)相同浓度的氨苄青霉素、镍离子和甘氨酸以除去甘氨酸-ON核糖开关，然后在补有80-100μg/mL氨苄青霉素但没有甘氨酸的M9培养基中过夜培养，然后转接至在补有80-100μg/mL氨苄青霉素和10-20μg/m四环素的M9培养基中，以富集甘氨酸-OFF核糖开光；同样，通过荧光细胞流式分选仪器对具有最高绿色荧光的克隆进行分选；

9)：将步骤7)和步骤8)中的菌株分别在新鲜M9固体培养基上培养12-24h，随机挑选单菌落至96深孔板中进行初步筛选；每个单菌落分别接种于添加质量比0.4-0.8％甘氨酸和不添加甘氨酸的深孔板中，37℃培养12-24h，然后分别检测在两种条件下的荧光强度和细胞生长量(OD₆₀₀)；经96深孔板筛选后，得到甘氨酸-ON和-OFF核糖开关振幅比值最大的菌株MG1655-BS-ON14和MG1655-BS-OFF6。

4.权利要求1或权利要求2得到的感应范围增加的甘氨酸-ON突变体和构象改变的甘氨酸-OFF突变体应用于大肠杆菌胞内基因表达调控。