[发明专利]基于靶向测序的病原微生物检测方法及试剂盒

说明书

本发明基于多重PCR，结合高通量的Nanopore纳米孔测序技术，可检测临床样本中可能存在的所有细菌、真菌。本发明提供一种基于靶向序列的病原微生物的检测方法，通过临床样本核酸提取、鉴定序列靶向扩增、产物末端修复、连接标签、连接测序接头、测序与数据分析等步骤，在6‑8小时即可完成病原微生物的检测。配套的试剂盒包括相应步骤所需试剂。该方法相比较现有技术，无需去除宿主基因组，核酸提取简单，病原覆盖全面，灵敏度高，检测通量高，检测速度快，鉴定更准确。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种基于靶向测序的病原微生物检测方法及试剂盒。

背景技术

近年来，造成人类感染的病原微生物日益复杂，种类增多，抗菌药物滥用致使细菌耐药，病原微生物已成为全球关注的焦点。在我国每年感染性疾病患者中，超过1亿的患者需要使用病原检测手段检查进行辅助治疗，其中危重感染病人人数超千万。针对这些感染类型较为复杂的危重感染病例，目前常规检测手段难以满足治疗需求。除此之外，新发现的病原微生物，以及耐药性不断增强的病原的出现，使得临床医生的经验性治疗会出现无效的现象。因此，快速明确病原菌是有效控制感染的基础。

传统的病原微生物鉴定技术分为培养和非培养两类，临床公认的“金标准”是分离培养和生化鉴定，这种方法的操作周期长、失败率高，并且不是每种病原体都可以培养。不依赖培养的方法比如涂片镜检、抗体抗原免疫等，在采样当天即可报告结果。这些方法的时效性强，但在敏感性和特异性上存在较明显的劣势，而且传统的微生物鉴定方法对于未知或者罕见的病原微生物，无法快速识别。

基于宏基因组的病原微生物检测技术(mNGS)是一种不依赖传统的微生物培养，也无需特异性扩增，直接对临床样本中的核酸进行无差别、无选择性的高通量测序，然后与已知的微生物序列数据库进行比对分析，根据比对到的序列信息来判断样本包含的病原微生物种类，能够快速、客观地检测临床样本中的病原微生物(包括病毒、细菌、真菌、寄生虫)。相比传统检验方法，mNGS拥有更高的敏感性及更快的检验速度，但在实际应用中，还有一些难以解决的问题，这也限制了其广泛应用：1)无法准确区分检出微生物是定制菌、背景菌、致病菌。2)mNGS技术对于胞内菌、真菌等核酸提取效率低的微生物检测敏感性较低。同时对于低浓度的胞内感染菌如结核分枝杆菌、军团菌的检测敏感性偏低。3)高宿主背景：一般样本类型如血液、肺泡灌洗液、痰液等，宿主基因组污染比例通常在80％以上，这导致检测到的微生物序列非常少，绝大部分数据都无法有效利用。4)标准难以统一：从测序结果的可靠程度来讲，不同的测序公司，对于结果数据采用不同的报告方式，如深度、覆盖度、丰度、置信度，各不相同，尚无统一标准。5)高成本：目前mNGS检测终端收费想多昂贵，如非危重症患者，一般难以接受检测。

纳米孔测序(Nanopore Targeted Sequencing)方法是一种代表性的基因检测技术，该方法不依赖于传统的微生物培养，能够快速、客观地检测出临床样本中的疑似致病微生物(包括细菌、真菌和病毒)。该检测项目基于第三代单分子测序(Nanopore)平台，是新一代单分子实时测序技术，其以单分子DNA(RNA)通过生物纳米孔的电流变化推测碱基组成而进行测序。其主要特点是读长更长，平均读长可达20kb,最长可达到Mb级别；结合高效的基因组核酸提取和建库方式，测序结果经过生物信息学处理分析后与专业医学微生物数据库进行比对分析，可以获得样本中所有微生物的种属信息以及所携带的耐药和毒力基因信息。该方法检测范围广，可高效检测静脉血、肺泡灌洗液、脑脊液、痰液及其他体液、组织等多种临床样本中的致病微生物，适用于不明原因发热、疑难感染和急危重症的诊断。

纳米孔靶向测序的测序速度快，在2个小时的测序及可以得到满足病原微生物分析的数据，同时通过靶向扩增的方式，可以无需进行人源基因组DNA的去除，就可以达到对病原微生物的富集。同时如果适配本发明开发快速建库技术，即可以在4-6个小时获得检测结果，非常适用于急危重症的诊断。

发明内容