[发明专利]动物组织中颠茄类生物碱的检测方法

权利要求书

1.一种动物组织中颠茄类生物碱的检测方法，其特征在于，包括：

样品制备，解冻后的待测动物组织清洗后，切块、捣碎，分装样品容器中，保存备用；

样品提取，称取样品5g试样，精确至0.01g，于50mL离心管中，加入50μL内标工作液涡旋混匀30s，并静止10min，加入15mL酸化乙腈旋涡混匀1min后，旋涡混匀1min后，35℃～55℃超声提取10min，取出冷却至室温，4500r/min离心5min，上清液转移至100mL鸡心瓶中；

将所述离心管内的去除上清液后的固体进行二次提取，得到第二次的上清液，将两次的上清液合并，45℃，旋转蒸发至近干，得到残渣；

样品净化，向所述残渣内加入50μL甲醇，水，溶解残渣，转移至2mL离心管中，用水定容至1.0mL，加入吸附剂，涡旋振荡30S，加入1mL正己烷，涡旋振荡10S，12000r/min离心5min，弃去上层油脂层，重复净化一次，至-20℃冷冻30min，12000r/min离心5min，下层清液经过滤后供液质使用；

样品检测，将所述过滤后的下层清液上机检测，检测条件包括：

色谱柱：InfinityLabPoroshell120HPH-C18(2.1mm×100mm，1.9μm)；流速：0.2mL/min；流动相：A相为5mM甲酸铵+0.1％甲酸；B相为甲醇，梯度洗脱；柱温：40℃，进样量：10μL；内外标法定量；

质谱离子源:ESI；离子源温度:100℃；干燥气流量:10L/h；毛细管电压:4000V；气流温度:350℃；雾化气压力:40psi；碰撞气类型:氮气；扫描方式:正离子；检测方式:MRM。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述吸附剂包括10mgPSA,10mg NH2、20mg中性氧化铝。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱条件以体积分数计，流速为0.2ml/min；在0～1min，流动相A相为95％，流动相B相为5％；在2～4min，流动相A相为90％，流动相B相为10％；在5min，流动相A相为50％，流动相B相为50％；在10min，流动相A相为20％，流动相B相为50％；在10～15min，流动相A相为95％，流动相B相为5％。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，将所述离心管内的去除上清液后的固体进行二次提取，包括：震散固体，加入15mL酸化乙腈，手摇上下震荡30s后，旋涡混匀加超声，得到第二次的上清液。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述下层清液过滤，包括：将所述下层清液经0.22μm滤膜过滤。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述动物组织包括：动物肌肉、肉、心、肝、肾、肺中的一种或多种。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，还包括：

标准储备液：分别称量适量山莨菪碱、消旋山莨菪碱、氢溴酸樟柳碱、硫酸阿托品、莨菪碱、东莨菪碱、氢溴酸后马托品、托品酸、去甲阿托品经折算后的山莨菪碱、消旋山莨菪碱、樟柳碱、阿托品、莨菪碱、东莨菪碱、后马托品、托品酸、去甲阿托品含量均为10mg，用甲醇定容至10mL棕色容量瓶中，制备为质量浓度为1000μg/mL标准储备液；

移取山莨菪碱、消旋山莨菪碱、樟柳碱、阿托品、莨菪碱、东莨菪碱、后马托品、托品酸、去甲阿托品标准溶液，用甲醇定容于10mL棕色容量瓶中,制备为质量浓度为1000ng/mL混合中间液；

在空白基质中分别加入10ng/mL混合标准溶液20μL、50μL、100μL、0.5mL、2mL，加入1000ng/mL混合标准溶液50μL、100μL、200μL，按照与样品相同提取与净化步骤进行处理，制备8个质量浓度标准溶液为0.2ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL和200ng/mL，后马托品为内标，内标法绘制工作曲线。