[发明专利]一种维生素k2

说明书

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种维生素Ksubgt;2/subgt;系列产物的生物合成方法，包括如下步骤：步骤一、敲除Bacillus subtilis168基因中的hepS基因，得到△hepS菌株BS01；步骤二、敲除Bacillus subtilis168基因中的hepT基因，得到△hepT菌株BS02；步骤三、PCR扩增大肠杆菌yqiD基因或Bacillus subtilis168的hepT基因；将所得PCR产物连接表达载体pHY‑P43得到重组质粒，之后转到BS02，即得产生维生素Ksubgt;2/subgt;系列产物的工程菌。该发明对于获取不同食品级维生素Ksubgt;2/subgt;同系物具有十分重要的意义。

技术领域

本发明及生物工程技术领域，尤其涉及一种维生素K₂系列产物的生物合成方法。

背景技术

作为一类重要的脂溶性维生素，维生素K₂在食品和医药领域都有着重要应用。健康人群适量补充富含维生素K₂食品，可有效减小骨折发病率。另外，越来越多的资料显示维生素K缺乏是引发世界性婴儿出血疾病和死亡的重要原因。并且，同辅酶Q相似，维生素K₂作为一种膜结合电子载体，具有修复损伤细胞线粒体的功能，这对于人类免受帕金森症愈后肺纤维化折磨起着重要的作用。由于这几方面的应用，国际市场对维生素K₂的需求近年来不断增加。

维生素K₂的合成通常采用微生物发酵法。该代谢产物的化学结构由一个甲基萘醌主链和n个异戊二烯侧链连接而成。根据侧链上异戊二烯的个数，通常以 MK-n表示，n通常为4-13。异戊二烯的个数，由合成的微生物决定。一般情况下，黄杆菌中主要合成MK-4，大肠杆菌合成MK-8，枯草芽胞杆菌代谢合成MK-7。n 的不同，其所具有的生物相容性、半衰期和疗效也都有差异。如MK-7的半衰期较MK-4，MK-8长，生物相容性更好；而MK-4生物合成量一般较MK-7，MK-8 高。

枯草芽胞杆菌作为一种被美国食品和药物管理局(Food and DrugAdministration，FDA)认证为食品安全微生物，在食品级维生素的合成有着重要的意义。然而，现有技术中并没有一种可以在同一种微生物-枯草芽胞杆菌中合成维生素K₂各种同系物的方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提出一种维生素K₂系列产物的生物合成方法，以解决现有技术中无法合成不同食品级维生素K₂同系物的问题。

基于上述目的，本发明提供了一种维生素K₂系列产物的生物合成方法，包括如下步骤：

步骤一、敲除Bacillus subtilis168基因中的hepS基因，扩增产物纯化后化学转化到Bacillus subtilis 168感受态细胞中，得到△hepS菌株BS01；

步骤二、敲除Bacillus subtilis168基因中的hepT基因，扩增产物纯化后化学转化到BS01感受态细胞中，得到△hepT菌株BS02；

步骤三、PCR扩增大肠杆菌yqiD基因或Bacillus subtilis168的hepT基因；将所得PCR产物连接表达载体pHY-P43得到重组质粒，之后转到BS02，即得产生维生素K₂系列产物的工程菌。

优选的，所述步骤一中得到△hepS菌株BS01的方法包括如下步骤：

A1、将Bacillus subtilis 168原始菌培养至指数生长中期，提取全基因组 DNA；

A2、将含有P7C6质粒的大肠杆菌JM109培养至指数生长中期，提取P7C6 质粒；