[发明专利]一种检测唾液酸糖基酪蛋白糖巨肽的方法

权利要求书

1.一种检测唾液酸糖基酪蛋白糖巨肽的方法，其特征在于包括如下步骤：以苯硼酸修饰介孔二氧化硅为硼亲和柱填料，利用苯硼酸对酪蛋白糖巨肽中丝氨酸和苏氨酸残基上特殊糖基-唾液酸的亲和特性，通过改变pH调控带有唾液酸糖基的酪蛋白糖巨肽的吸附和洗脱，再以液相色谱-串联质谱分析，实现对苯丙酮尿症特殊医学用途配方食品中酪蛋白糖巨肽的检测；步骤如下：(1)样品制备：准确称取已充分均质样品5-10g于烧杯中，加入20-30mL去离子水溶解，磁力搅拌、加热至90℃溶解，冷却至室温后用盐酸调节pH至4.5-5.0，定容到50mL，转移到离心管中，离心，取20mL上清液为样品液；

(2)硼亲和柱富集净化；Step1介孔二氧化硅的合成：0.25-0.3g十六烷基三甲基溴化铵溶于240-250mL水中，向其中加入2.0mol/L的0.8-1.0mL NaOH，升温至80℃，剧烈搅拌，将5-7mL正硅酸乙酯滴加入溶液中，混合物继续搅拌反应2-5h，产生白色絮状物；离心弃去上清液，保留沉淀，用水和甲醇分别洗涤三次，60℃真空干燥，之后将0.4-0.5g上述沉淀分散于150-160mL含有1.5-2.0mL浓盐酸的甲醇溶液中，回流5-8h之后离心，沉淀60℃真空干燥，得到介孔二氧化硅；

Step2介孔二氧化硅的氨基化：称取0.3-0.4g介孔二氧化硅，分散于80-90mL无水甲苯中，加入0.5-2mL氨丙基三乙氧基硅烷，氮气保护加热回流20-24h，离心，沉淀用甲苯和甲醇分别洗涤三次后真空干燥，得到氨基化的介孔二氧化硅；

Step3氨基化介孔二氧化硅的苯硼酸修饰：称取0.2-0.3g氨基化介孔二氧化硅分散于20-25mL二甲亚砜中，将0.8-1.0g的4-羧基苯硼酸、0.1-0.2g N-羟基琥珀酰亚胺、0.05-0.1g1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐依次加入5-10mL二甲亚砜中反应，在室温下搅拌30-60min后加入到上述氨基化介孔二氧化硅分散液中，室温下搅拌10-24h，离心，沉淀用二甲亚砜、水、甲醇分别洗涤三次，真空干燥，得到苯硼酸修饰的介孔二氧化硅；

Step4硼亲和柱制备：将20mg苯硼酸修饰的介孔二氧化硅装到聚乙烯固相萃取管中，加上筛板，压实，制得硼亲和柱；硼亲和柱上样品液，上样结束后，用pH为4.5-5.0的盐酸水溶液淋洗，抽干柱内残留液，并弃去以上全部流出液，最后用2mL pH值为1.0的盐酸水溶液洗脱，洗脱液冻干，再用1mL液相色谱流动相重新溶解、定容，得到净化液，以上淋洗和洗脱液的pH值仅适用于唾液酸糖基酪蛋白糖巨肽的淋洗和洗脱，不适用于其他糖基化修饰的酪蛋白糖巨肽；

(3)液相色谱-串联质谱分析：净化液经滤膜过滤后供液相色谱-串联质谱仪检测，获得酪蛋白糖巨肽的离子流色谱图和质谱图，将离子流色谱图的峰面积带入标准曲线分析计算，并结合质谱图进行结构鉴定，从而获得样品中带有唾液酸糖基的酪蛋白糖巨肽的含量和结构信息。

2.根据权利要求1所述的检测唾液酸糖基酪蛋白糖巨肽的方法，其特征在于：在步骤(3)中，用于重新溶解多肽的流动相配比为：含0.1％甲酸的乙腈水溶液所述的水和乙腈的体积比为90:10。

3.根据权利要求1所述的检测唾液酸糖基酪蛋白糖巨肽的方法，其特征在于：在步骤(3)中，色谱条件为：色谱柱：Agilent AdvanceBio PeptideMapping柱；柱温：40℃；进样体积：10μL；流速0.3mL/min；流动相A为含有0.1％甲酸的乙腈水溶液，所述的水和乙腈的体积为90:10；流动相B为含有0.1％甲酸的乙腈溶液，梯度洗脱：0-5min，98％A；5-55min，98％-50％A；55-60min，50％-10％A；60-75min，10％A。

4.根据权利要求1所述的检测唾液酸糖基酪蛋白糖巨肽的方法，其特征在于：在步骤(3)中，质谱条件为：电喷雾离子源；正离子扫描；喷雾电压：5500V；温度：450℃；检测方式：数据依赖型扫描。

5.根据权利要求1所述的检测唾液酸糖基酪蛋白糖巨肽的方法，其特征在于：在步骤(3)中，标准曲线的制作方法为：配制浓度为0.1-50μg/mL的酪蛋白糖巨肽标准溶液，以酪蛋白糖巨肽浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，制作标准曲线。