[发明专利]苹果β-半乳糖苷酶基因Mdβ-gal18及在调控果实成熟软化中的应用

说明书

本发明公开了一种苹果β‑半乳糖苷酶基因Mdβ‑gal18及在调控果实成熟软化中的应用，分析了该基因在不同处理苹果果实采后贮藏过程中的表达模式，利用瞬时过表达和VIGS技术验证Mdβ‑gal18基因在苹果果实后熟软化中的作用，发现过表达Mdβ‑gal18基因的苹果果实与对照果实相比，乙烯释放显著升高，硬度显著降低，果实颜色明显变黄；而沉默Mdβ‑gal18基因的苹果果实乙烯释放显著降低，果实颜色偏青。说明该基因可以调控苹果果实后熟软化，对培育耐贮运的苹果新品种具有积极的指导作用。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及苹果β-半乳糖苷酶基因Mdβ-gal18及在调控果实成熟 软化中的应用。

背景技术

质地是影响果实品质的重要指标，同时也是决定果实采后贮藏寿命的重要内在因子(Li 等，2010)，其中软化是果实采后质地变化最为常见的形式。苹果是典型的呼吸跃变型果实， 采后贮藏性虽优于桃、柿等水果，但不同品种间贮藏性差异很大：‘富士’等晚熟品种贮藏过 程中果实硬/脆度变化不大，而‘嘎拉’、‘金冠’和‘红星’等早/中熟苹果品种在采后贮藏过程中易 发生软化，严重影响果实口感及耐贮性，降低商品价值(齐秀东等，2015；张宗营，2016； Ge等，2019)。果实质地变化是其细胞壁结构与组分变化的表现，果胶作为细胞壁的主要组 分，其降解是导致果实软化的关键，而β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，β-gal)水解果胶侧链上 的半乳糖是造成果实软化的重要原因之一(Tateishi等，2008)。因此，研究苹果中β-gal酶编 码基因的功能对提高苹果果实耐贮性具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种β-半乳糖苷酶基因Mdβ-gal18及在调控果实成熟软化中的应 用。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种苹果β-半乳糖苷酶基因Mdβ-gal18，所述基因Mdβ-gal18的DNA序列如SEQ IDNO：1 所示，共2196bp；所述基因Mdβ-gal18编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，共编码 731个氨基酸。

包含上述苹果β-半乳糖苷酶基因Mdβ-gal18重组载体，也落入本发明的保护范围，本发 明所选用的重组载体为农杆菌过表达载体。

本发明还公开了上述基因超表达载体构建方法，具体为：

设计带有限制性酶切位点的特异引物扩增Mdβ-gal18基因CDS序列，利用同源重组方法 将Mdβ-gal18基因整合到超表达载体pRI-101上，构建35S::Mdβ-gal18重组质粒，并通过电 击法转化至GV3101农杆菌。引物序列如下：

Mdβ-gal18-FP：TCTTCACTGTTGATACATATGATGGGTGTTGGAATTCAAA；

Mdβ-gal18-RP：CGATCGGGGAAATTCGAGCTCCTAGAGCTTCTTCGCGTCG。

上述基因VIGS载体的构建方法，具体为：

设计带有限制性酶切位点的特异引物，扩增Mdβ-gal18基因cDNA非保守区200-400bp 片段，利用同源重组方法将所扩增片段插入到TRV2载体中，构建完成pTRV2-Mdβ-Gal18重 组质粒，并通过电击法转化至GV3101农杆菌。引物序列如下：

Mdβ-Gal18-TRV-FP：ATTCTGTGAGTAAGGTTACCGAATTCGTCAAAACGTGAAC；

Mdβ-Gal18-TRV-RP：TCTTCGGGACATGCCCGGGCCTCGAGGTACCATGTAAGGG。