[发明专利]定量检测抗虫蛋白Cry 3Bb的酶联免疫试剂盒及其检测方法

说明书

一种定量检测转基因玉米中抗虫蛋白Cry 3Bb的酶联免疫试剂盒及其检测方法，所述酶联免疫试剂盒由包被捕获抗体的微孔反应板、样品处理液、生物素标记的检测抗体、标准品、辣根过氧化物酶标记的亲和素、生物素标记的抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记的亲和素稀释液、浓缩洗涤液、底物溶液、终止液和板贴组成，从而具有操作简便、能同时快速检测大批样品，具有高灵敏度、高特异性的特点。

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体涉及到一种定量检测转基因玉米中抗虫蛋白Cry3Bb的酶联免疫试剂盒及其检测方法。

背景技术

苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是一种广泛存在的革兰氏阳性菌，该菌分泌的抗虫晶体蛋白是目前主要的生物农药；分泌的抗虫蛋白按照氨基酸序列相似性被分为两类：Cry和Cryδ-内毒素。其中Cry蛋白对多种有害昆虫(如鳞翅目，双翅目，鞘翅目，线虫类和原生生物等)幼虫具有毒性。Cry毒素已经被转入多种农作物使其具有抗虫性。Cry3Bb蛋白是Cry毒素中的一种。目前转Cry基因的农作物主要有玉米、土豆、玉米、棉花等。

转基因技术的发展与进步推动了生物学的发展。转基因食品虽然能够满足人们对产量、抗虫性等方面的要求，但同时也对人类的生活带来了一些潜在的威胁，如某些基因导入宿主之后会使食品产生毒性，转基因食物产生过敏原，使人产生抗药性，食品的营养价值发生改变等。在进行转基因食品研究开发和商业化的同时，为了对转基因食品的安全性给予综合评估，使消费者能够快速区分转基因食品与天然食品，建立合适的方法对转基因食品中转基因成分进行鉴定与检测，能够促进农业转基因生物安全管理，保障人和动物以及微生物的安全，同时能够保护生态环境，促进农业转基因生物技术的进一步研究。为了对转基因作物或者其衍生物中Cry 3Bb蛋白进行快速的定量分析，研究开发Cry 3Bb酶联免疫试剂盒具有非常大的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种定量检测转基因玉米中抗虫蛋白Cry 3Bb的酶联免疫试剂盒及其检测方法，其具有操作简便、能同时快速检测大批样品，具有高灵敏度、高特异性的特点。

为实现上述目的，本发明提供了一种定量检测转基因玉米中抗虫蛋白Cry3Bb的酶联免疫试剂盒，所述酶联免疫试剂盒由包被捕获抗体的微孔反应板、样品处理液、生物素标记的检测抗体、标准品、辣根过氧化物酶标记的亲和素、生物素标记的抗体稀释液、辣根过氧化物酶标记的亲和素稀释液、浓缩洗涤液、底物溶液、终止液和板贴组成。

其中，样品处理液的配方为：

生物素标记的检测抗体：100μg/mL生物素标记的Cry 3Bb 2H11 1H1鼠单抗(PBS,50％甘油)溶液；

标准品：50ng的His-Cry 3Bb重组蛋白(冻干粉)，所述His-Cry 3Bb重组蛋白是通过将Cry 3Bb编码基因进行扩增、测序，鉴定正确以后与pET28a质粒连接，将重组表达载体pET28a-Cry 3Bb转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，保存的重组蛋白Cry 3Bb表达菌株复苏培养，用IPTG于16℃过夜诱导表达蛋白，并通过重组蛋白纯化得到；

辣根过氧化物酶标记的亲和素：1:40辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase)标记的亲和素(avidin)母溶液(金开瑞公司)，工作液以1:100倍稀释；

生物素标记的抗体稀释液/辣根过氧化物酶标记的亲和素稀释液配方：

浓缩洗涤液：含有1.0％Tween-20的10×PBS；

底物溶液：0.5mL 2mg/mL TMB无水乙醇溶液，10mL底物缓冲液，32μL30％H₂O₂混合，现用现配；

终止液：1M H₂SO₄。