[发明专利]适配体功能化UCST型温敏嵌段聚合物及其同步分离纯化、固定化细胞色素C的应用

权利要求书

1.适配体功能化UCST型温敏嵌段聚合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)RAFT链转移剂CTA的制备

将3-巯基丙酸滴入氢氧化钾水溶液中，在搅拌下逐滴滴加二硫化碳至溶液中，在室温下反应结束后，将溴化苄滴入反应溶液中，然后将溶液加热搅拌回流，反应结束冷却至室温后，将混合物溶液倒入三氯甲烷中，滴加盐酸酸化至有机相转变为黄色，随后，用过量的去离子水洗涤混合物，得到有机相，有机相经无水硫酸钠干燥后，减压浓缩，加入适量的二氯甲烷后，置于冰箱，待产物结晶析出，用去离子水洗涤粗产物晶体，将所得的粗产物溶于三氯甲烷中，减压浓缩、重结晶，重复上述操作数次，最后，将所得产物置于真空干燥箱中干燥过夜，得到黄色固体，即RAFT链转移剂CTA；

(2)PEG大分子链转移剂PEG₄₅-CTA的制备

A、将聚乙二醇单甲醚(PEG₄₅-OH)和步骤(1)制备的CTA溶于无水二氯甲烷中，得到溶液A，放置于冰水浴中；

B、将4-二甲氨基吡啶和N,N’-二环己基碳二亚胺溶于二氯甲烷中，得到溶液B；

C、将溶液B逐滴滴入溶液A中，在室温下反应结束后，过滤除去不溶盐，将所得的滤液减压浓缩，并用过量的冰乙醚沉淀，将获得的沉淀物溶解在无水二氯甲烷中，减压浓缩，用过量的冰乙醚沉淀，重复上述步骤数次，将所得沉淀置于真空干燥箱中室温干燥过夜，得到淡黄色固体，即PEG大分子链转移剂PEG₄₅-CTA；

(3)两嵌段聚合物PEG₄₅-b-P(GMA₂₁-co-AAc₁₄₀)的制备

将步骤(2)制备的PEG₄₅-CAT，丙烯酸(AAc)，甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)和引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)溶于1,4-二氧六环中，转移至带有磁子的单口圆底烧瓶中，氮气鼓泡一段时间除去反应溶液中的氧气，在氮气气氛下密封，然后，将圆底烧瓶置于油浴锅中搅拌反应，待冰水浴淬灭反应后，用1,4-二氧六环稀释，并加入到过量的无水乙醚中沉淀，将所得的产物重新溶于1,4-二氧六环中，再用无水乙醚沉淀出产物，重复溶解-沉淀三次后，将所得产物置于真空干燥箱中干燥过夜，得到淡黄色固体,即两嵌段聚合物PEG₄₅-b-P(GMA₂₁-co-AAc₁₄₀)；

(4)UCST型温敏嵌段聚合物PEG₄₅-b-PAAm₁₇₆-b-P(GMA₂₁-co-AAc₁₄₀)的制备

将步骤(3)制备的PEG₄₅-b-P(GMA₂₁-co-AAc₁₄₀)、丙烯酰胺(AAm)和引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，转移至带有磁子的单口圆底烧瓶中，氮气鼓泡30min后，在氮气气氛下密封，然后，将圆底烧瓶置于油浴锅中搅拌反应，冰水浴淬灭反应后，用N,N-二甲基甲酰胺稀释反应，并加入到过量的无水乙醚中沉淀，将所得的产物重新溶于N,N-二甲基甲酰胺中，再用无水乙醚沉淀出产物，重复溶解-沉淀三次后，将所得产物置于真空干燥箱中干燥过夜，得到米白色固体，即为UCST型温敏三嵌段聚合物PEG₄₅-b-PAAm₁₇₆-b-P(GMA₂₁-co-AAc₁₄₀)；

(5)适配体功能化UCST型温敏嵌段聚合PEG₄₅-b-PAAm₁₇₆-b-P(GMA₂₁-co-AAc₁₄₀)-Apt的制备

A、在精密pH计监测下，用柠檬酸溶液调节磷酸氢二钠溶液的pH，得到pH为7.0的磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲溶液；

B、将步骤(4)制备的聚合物PEG₄₅-b-PAAm₁₇₆-b-P(GMA₂₁-co-AAc₁₄₀)溶于上述缓冲溶液中，得到PEG₄₅-b-PAAm₁₇₆-b-P(GMA₂₁-co-AAc₁₄₀)溶液；

C、将Cyt c的适配体(Apt)溶解于上述缓冲溶液中，与PEG₄₅-b-PAAm₁₇₆-b-P(GMA₂₁-co-AAc₁₄₀)溶液混合均匀后，放入恒温振荡箱中恒温孵育，随后，加入过量的甘氨酸继续反应，用于封闭未完全反应的环氧基团，待反应结束，降低温度的同时用HCl溶液降低溶液pH值，离心分离获得PEG₄₅-b-PAAm₁₇₆-b-P(GMA₂₁-co-AAc₁₄₀)-Apt粗产物，并去除未参与反应的适配体，将所得粗产物用上述缓冲溶液溶解，再降低温度和pH值沉淀析出产物，重复溶解-沉淀三次后，离心分离获得PEG₄₅-b-PAAm₁₇₆-b-P(GMA₂₁-co-AAc₁₄₀)-Apt产物。