[发明专利]特异性核酸荧光染色反应液及其在精子DNA完整性检测中的应用

权利要求书

1.特异性核酸荧光染色反应液，其特征在于包括以下四者：精液稀释液，酸化液，荧光染料，染料稀释液；

精液稀释液：0.01mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、0.15mol/L氯化钠、1mmol/L乙二胺四乙酸二钠；余量为水；pH为7.3；

酸处理液：0.08mol/L盐酸、0.15mol/L氯化钠、0.1％(体积％)曲拉通X-100，余量为水；

荧光染料为SGGV荧光染料，由SYBR GreenI与GoldView这两种染料组成，使用前按比例混合而成；

染色稀释液：40mmol/L Tris-乙酸；2mmol/L EDTA，余量为水；pH 8.0。

2.检测精子DNA碎片化的方法，利用如权利要求1所述的特异性核酸荧光染色反应液，其特征在于依次进行如下步骤：

1)、配制荧光染料：

将SYBR GreenI与染色稀释液按照1:500的体积比混合，得SYBR GreenI稀释液；

将GoldView与染色稀释液按照1:500的体积比混合，得GoldView稀释液；

然后，将SYBR GreenI稀释液与GoldView稀释液等体积比混合，得SGGV荧光染料；

2)、细胞的制备：

当为新鲜精液样本时，在室温液化30±2分钟；当为冷冻后精液样本时，于冰上，将解冻后的精液样本充分混匀；得待测精液样本；

于冰上，在待测精液样本中加入精液稀释液充分混匀，得稀释后精液；

所述待测精液样本：精液稀释液＝1:9的体积比；

3)、细胞的裂解和染色：

继续于冰上，向步骤2)所得的稀释后精液加入酸处理液于振荡条件下进行酸裂解处理30±2秒，从而增加细胞的通透性；再加入SGGV荧光染料，先振荡10±1秒钟，而后静置避光染色5±0.5分钟，得染色后反应液；

稀释后精液：酸处理液＝1:1的体积比；

稀释后精液：SGGV荧光染料＝1:6的体积比；

4)、上机检测：

于2～8℃，将步骤3)所得的染色后反应液离心，去除上清，将底液震荡混匀；

然后涂片，盖片后于荧光显微镜下，于280nm、480nm中的至少一个激发条件下拍照；

5)、结果判断：

拍照结果显示发出绿色荧光的为正常精子细胞；发出橘黄色、红色荧光的为碎片化精子细胞。

3.根据权利要求2所述的检测精子DNA碎片化的方法，其特征在于：

步骤4)为：先用280nm的紫外光激发后拍一次照，然后用480nm的蓝光激发后再拍一次照片；

还包括步骤6)：计算样本中的DNA损伤比例。

4.根据权利要求3所述的检测精子DNA碎片化的方法，其特征在于所述步骤6)为：以色调H、饱和度S、亮度V构建HSV颜色模型；利用图像识别软件对图片中的精子进行HSV颜色的识别。

5.根据权利要求4所述的检测精子DNA碎片化的方法，其特征在于所述步骤6)包括如下步骤：

①、对于280nm和480nm两个激发光拍的照片，结果一致的精子细胞纳入统计分析；

②对步骤①所得的纳入统计分析的精子细胞进行纯度S值的判定，对S值≥43的精子细胞进行下述步骤③；

③对步骤②所得的精子细胞进行色彩明亮程度V值判定，对V值≥46的精子细胞进行下述步骤④；

④对步骤③所得的精子细胞进行色彩H值的判定：

在[35，77]区间的定义为绿色，为低DFI的精子；

H值在[0,34]以及[156,180]区间的为中高DFI的精子；

⑤、DFI指数＝高DFI的精子数量/纳入统计的精子数量X 100％。

6.根据权利要求5所述的检测精子DNA碎片化的方法，其特征在于所述步骤①：

同时满足以下2个条件的绿色荧光点纳入统计分析：在280nm波长和在480nm波长下均成像为绿色荧光点，且在480nm波长下显示带有精子尾巴。