[发明专利]一种鲜味物质丰富的重组条斑紫菜藻株及构建方法与应用

说明书

本发明属于海洋生物领域，具体涉及一种鲜味物质丰富的重组条斑紫菜藻株及构建方法与应用。将条斑紫菜内源性NyAMPD基因完整的CDS插入转化载体中，而后导入至条斑紫菜野生藻株中，即获得鲜味物质丰富的重组条斑紫菜藻株。本发明构建的鲜味物质丰富的重组条斑紫菜藻株是通过遗传转化实现NyAMPD在条斑紫菜藻株中的过表达，使重组后藻株的IMP含量得到显著提升，同时生长速度也显著加快，具有重要的经济价值。

技术领域

本发明属于海洋生物领域，具体涉及一种鲜味物质丰富的重组条斑紫菜藻株及构建方法与应用。

背景知识

条斑紫菜(Neopyropia yezoensis)是一种重要的大型经济海藻，其营养丰富、味道鲜美。条斑紫菜的鲜味主要来源于谷氨酸盐和肌苷5’-单核苷酸(IMP)两种物质，在谷氨酸盐饱和的情况下，IMP含量与紫菜鲜味呈线性关系。IMP是5’-单磷酸腺苷(AMP)在腺苷酸脱氨酶(AMPD)的催化下进行脱氨反应的直接产物。因此，提高AMPD基因的表达量，则有望提高IMP的含量从而提升紫菜的口感。

在紫菜采收过程中，最早收割的紫菜(称为头水紫菜)口感最好，往后口感依次递减。目前紫菜等大型海藻的良种选育大多采用自然选育和诱变育种等方式，尚无通过精准分子育种方式提升紫菜经济性状的报道。

发明内容

本发明提供了一种鲜味物质丰富的重组条斑紫菜藻株及构建方法与应用。

为获得上述藻株，本发明采用技术方案为：

一种鲜味物质丰富的重组条斑紫菜藻株的构建方法，将条斑紫菜内源性NyAMPD基因完整的CDS插入转化载体中，而后导入至条斑紫菜野生藻株中，即获得鲜味物质丰富的重组条斑紫菜藻株。

所述内源性NyAMPD基因的GenBank序列号为：AB599724.1；

所述遗传转化的初始载体的启动子为PyAct1，终止子为NOS。

所述遗传转化的初始载体为pEA7-NyAct1::AmCFP。

将条斑紫菜内源性NyAMPD基因完整的CDS替换初始载体中的报告基因AmCFP片段，使NyAMPD基因的完整CDS插入到转化载体的启动子和终止子之间获得NyAMPD过表达质粒，通过基因枪法将重组载体转入条斑紫菜野生型中，而后经过抗生素筛选，即得NyAMPD过表达重组条斑紫菜藻株。

所述NyAMPD过表达质粒包裹于金粉粒子上，利用基因枪将其轰击至条斑紫菜叶状体细胞。

所述的抗生素筛选过程是以含终浓度为1mg/ml潮霉素的培养基培养转化后材料，每星期换一次培养基，经过6-8周的筛选后，挑取存活单株材料分开培养用作后续验证。

所述DNA水平验证是收集存活单株培养的材料进行基因组DNA的提取和纯化，以此为模板进行PCR验证，对在目的片段处出现明亮单一条带的扩增样本进行DNA测序以确认。

所述RNA水平验证是收集阳性突变株材料，进行RNA的提取和cDNA反转，再通过荧光定量的方法测定NyAMPD基因的表达量。

所述生长速度测定是分别测量初始和培养3周后突变株与野生型的鲜重和叶片长、宽，用以衡量生长差异。

一种按所述方法通过高表达内源性腺苷酸脱氨酶(NyAMPD)构建获得鲜味物质丰富的重组条斑紫菜藻株。

一种所述鲜味物质丰富的重组条斑紫菜藻株在调控藻株生长中的应用。

本发明的优点：