[发明专利]利用荧光定量PCR检测人源脐带间充质干细胞制剂中细菌的方法

权利要求书

1.利用荧光定量PCR检测人源脐带间充质干细胞制剂中细菌的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

(1)将人源间充质干细胞制品进行离心弃上清后，向沉淀中加入裂解液破环细菌细胞壁后，提取纯化获得细菌DNA；

(2)对样本DNA进行荧光定量PCR检测；

(3)通过Ct值判断样本的结果。

2.根据权利要求1的方法，其特征在于，步骤(1)中，DNA提取的具体步骤：

1)取200μl细胞制品，高速离心弃上清后作为样品组；

取200μl DNA洗脱液，高速离心弃上清后作为阴性对照组；

2)适用革兰氏阳性菌DNA提取：取150～200μl适宜浓度的破壁酶分别加入上述两组中，涡旋混匀；30～40℃孵育20-40min；加入20μl蛋白酶K和200μl裂解缓冲液，涡旋混匀；50～60℃孵育后转至90～100℃孵育；

适用革兰氏阴性菌DNA提取：取150～200μl裂解液分别加入上述两组中，涡旋混匀，瞬时离心；加入20μl蛋白酶K，涡旋混匀，瞬时离心，50～60℃孵育10-15min，瞬时离心；加入200μl裂解缓冲液，涡旋混匀，瞬时离心，65～75℃孵育5～15min，瞬时离心；

3)加入200μl无水乙醇，漩涡，瞬时离心；

4)将混合物转移至分离柱中，放置在收集管中，高速离心，将收集管丢弃；

5)将分离柱放入新的收集管中，加入500μl缓冲液1，高速离心，将收集管丢弃；

6)将分离柱放入新的收集管中，加入500μl缓冲液2，高速离心数分钟，将收集管丢弃；

7)将分离柱放入新的收集管中，高速离心；

8)将分离柱放入新的1.5mlEP管中，加入20～200μlDNA洗脱液，室温孵育数分钟，高速离心，洗脱DNA；

9)将上一步骤中的DNA洗脱液重新加入到分离柱中，室温孵育数分钟，高速离心，重新洗脱DNA。

3.根据权利要求1的方法，其特征在于，步骤(2)中，荧光定量PCR检测

1)反应液配制；

2)按18μl/孔加入反应液，再根据反应组别加入2μl/孔各组样品DNA，总体积为20μl/孔；

3)循环进行检测。

4.根据权利要求3的方法，其特征在于，步骤(2)中的1)，各组分配制反应液的量为：Premix ExTaqTM：10μl；16s-F：0.4μl；16s-R：0.4μl；16s-Probe：0.4～0.8μl；ROX：0.1～0.2μl；PCR-grade water：6.2～6.7μl；总体积：18μl。

5.根据权利要求3的方法，其特征在于，步骤(2)中的2)，反应组别为

1)组别：样品组；加入样品类型：提取的样品DNA；

2)组别：阴性对照组；加入样品类型：提取的洗脱液DNA；

3)组别：阳性对照组；加入样品类型：阳性对照品DNA；

4)组别：空白对照组；加入样品类型：洗脱液。

6.根据权利要求3的方法，其特征在于，步骤(2)中的3)，先95℃保温30s；再95℃保温5s，60℃保温34s的顺序40个循环进行检测。

7.根据权利要求1的方法，其特征在于，步骤(3)中，结果判断标准为

1)当阳性对照组扩增曲线呈S型，且Ct值＜31；阴性对照、空白对照扩增曲线不呈S型或Ct值≥31或无Ct值，方可判断样品结果；

2)当样品扩增曲线呈S型，且Ct值＜31，判断结果为阳性；

当样品扩增曲线不呈S型或Ct值≥31或无Ct值，判断结果为阴性。