[发明专利]一种负载MSCs可注射自修复水凝胶及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种负载MSCs可注射自修复水凝胶及其制备方法和应用，制备方法包括以下步骤：步骤一、合成四臂聚乙二醇苯甲醛；步骤二、合成羧甲基壳聚糖；步骤三、制备负载MSCs水凝胶：将聚乙二醇苯甲醛溶解于细胞完全培养基中，得到聚乙二醇苯甲醛溶液；将羧甲基壳聚糖溶解于细胞完全培养基中，得到羧甲基壳聚糖溶液；细胞完全培养基含有MSCs；将聚乙二醇苯甲醛溶液和羧甲基壳聚糖溶液混合均匀得到负载MSCs可注射自修复水凝胶。负载MSCs后水凝胶中的离子键及基团能够与MSCs相互作用，提高了MSCs的免疫调节及血管形成能力。用于皮下注射能够增加MSCs在体内的存在时间，使得MSCs移植便于转化为临床应用，并在组织再生和自身免疫性疾病领域具有良好的应用前景。

技术领域

本发明属于生物医学工程技术领域，涉及一种负载MSCs的可注射材料，尤其涉及一种负载MSCs可注射自修复水凝胶及其制备方法和应用。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)来源广泛，存在于多种组织如骨髓、脐带血和脐带组织、胎盘组织、脂肪组织等，具有多向分化、造血、组织修复和免疫调节等功能。在临床中已经应用于治疗多种疾病如：移植抗宿主病、缺血性脑病、终末期肝脏疾病和自身免疫性疾病等。目前临床应用中主要为体内静脉输注MSCs细胞，因此面临诸多问题，首先静脉输注后细胞在体内存活时间很短，影响MSCs效果的发挥以及疗效的巩固，其次，不同来源的MSCs具有异质性很难保证疗效的统一及治疗的重复性。再次，多次输注MSCs价格昂贵对不少患者来说很难接受。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种利用希夫碱反应原位成胶的方式制备负载MSCs的可注射自修复水凝胶的方法，通过水凝胶负载MSCs能够促进细胞增殖，并且体内实验表明水凝胶负载后增加了MSCs在体内的存在时间，利用系统性硬皮病模型鼠进行动物实验表明皮下注射负载MSCs的水凝胶能够改善疾病鼠的皮肤纤维化程度和疾病进程。

为实现上述目的，本发明提供一种负载MSCs可注射自修复水凝胶的制备方法，具有这样的特征：包括以下步骤：

步骤一、合成四臂聚乙二醇苯甲醛：

将聚乙二醇、4-甲酰苯甲酸、4-二甲氨基吡啶溶解于四氢呋喃中，充氮气下加入N,N'-二环己基碳酰亚胺，上述溶液在室温下搅拌反应24h，透析并干燥后洗涤，得到四臂聚乙二醇粉末；

步骤二、合成羧甲基壳聚糖：

将壳聚糖溶解于异丙醇中，并于室温中均匀搅拌；将氢氧化钠溶液滴加到上述溶液中，继续搅拌30min；将水一氯乙酸逐滴加入上述溶液；混匀后在60℃条件下搅拌反应3h；洗涤干燥获得羧甲基壳聚糖粉末；

步骤三、制备负载MSCs水凝胶：

将聚乙二醇苯甲醛溶解于细胞完全培养基中，得到聚乙二醇苯甲醛溶液；将羧甲基壳聚糖溶解于细胞完全培养基中，搅拌溶解后得到羧甲基壳聚糖溶液；制备聚乙二醇苯甲醛溶液或/和制备羧甲基壳聚糖溶液的细胞完全培养基含有MSCs；分别量取相同体积的聚乙二醇苯甲醛溶液和羧甲基壳聚糖溶液，混合均匀得到负载MSCs可注射自修复水凝胶。

进一步，本发明提供一种负载MSCs可注射自修复水凝胶的制备方法，还可以具有这样的特征：其中，步骤一中，所述聚乙二醇、4-甲酰苯甲酸、4-二甲氨基吡啶与N,N'-二环己基碳酰亚胺的质量比为6∶2∶0.01∶3.5。

进一步，本发明提供一种负载MSCs可注射自修复水凝胶的制备方法，还可以具有这样的特征：其中，步骤二中，所述壳聚糖、异丙醇、氢氧化钠、水一氯乙酸的用量比为5g∶50mL∶0.25mol∶50mL。

进一步，本发明提供一种负载MSCs可注射自修复水凝胶的制备方法，还可以具有这样的特征：其中，步骤三中，细胞完全培养基为DMEM-F12培养基，DMEM-F12培养基的组成为10％FBS和1％P/S。