[发明专利]一种刺激-响应型双靶点DNA纳米治疗体系及其构建方法和应用

说明书

本发明属于生物医药领域，涉及一种纳米治疗体系，特别是指一种刺激‑响应型双靶点DNA纳米治疗体系及其构建方法和应用。将三条单链直链DNA溶于体外缓冲盐溶液中，退火自组装形成具有三磷酸腺苷(ATP)响应的DNA纳米结构；95℃慢退火至4℃，完成双靶点DNA纳米治疗体系的构建。该DNA纳米治疗体系在生物体内ATP作用下解链后，分别作用不同的靶点，发挥治疗作用。本发明所构建的刺激‑响应型双靶点DNA纳米结构，制备方法简单，不仅可提高单独适配体的稳定性，还可以增强双靶点DNA纳米治疗体系的靶向性，主要通过调控细胞信号通路发挥生物治疗作用。

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种纳米治疗体系，特别是指一种刺激-响应型双靶点DNA纳米治疗体系及其构建方法和应用。

背景技术

核酸适配体是指单链RNA或从大量的寡核苷酸随机文库中筛选而来，具有高特异性、低免疫原性、易大规模合DNA分子，可通过折叠形成独特的二级或三级结构，并能够与靶分子特异性结合。适配体可通过SELEX技术成且批次间变化小、物理稳定性好以及易于化学修饰等特点。

类风湿关节炎( rheumatoid arthritis，RA) 是一种常见的、以慢性滑膜炎症为特征的自身免疫性疾病，其病理特征表现为滑膜组织异常炎性增生、血管新生、血管翳形成、关节软骨和骨的不可逆性破坏，甚至引发畸形病变以及严重的并发症。RA患者关节滑膜微环境中常显示关节腔缺氧、众多炎性因子浸润、内皮细胞损伤和应激等特点，均可导致内皮细胞通透性改变，从而增加免疫细胞粘附，释放三磷酸腺苷（ATP）。在生理条件下，细胞外ATP浓度约为10 nM，由锚定在质膜中的外核苷酸酶调控。然而，在病理进程中，细胞外ATP浓度可达到数百个微摩尔水平。细胞外ATP水平升高可激活腺苷受体P2，常导致炎症反应，而抗炎反应则通过腺苷与特定的腺苷受体P1结合而发生。ATP作为一种与损伤相关的分子模式 (DAMP)，通过正反馈，在促进RA早期的炎症过程和延长免疫激活方面发挥着重要作用。

肿瘤坏死因子（TNF-α）是一种重要的促炎因子，在各种慢性炎症尤其是RA的发病机制中起着至关重要的作用。TNF-α主要通过结合TNF受体1（TNFR1）和TNF受体2（TNFR2）来发挥其活性。研究表明，TNFR1激活不仅可以引发促炎反应，而且也可诱导凋亡的相关信号通路。核酸适配体TR1可以特异性结合TNFR1，阻断下游相关信号通路，从而达到治疗类风湿性关节炎的效果。

DEK是一种能够转移到细胞质，并进一步被分泌到细胞外的核蛋白，参与自身免疫反应。研究发现DEK蛋白在中性粒细胞胞外网状陷阱（NETs）的形成中发挥着至关重要的作用，核酸适配体DTA (41 nt) 可特异性结合DEK蛋白，抑制NETs形成，进而发挥抗关节炎的作用。

分别针对肿瘤坏死因子（TNF-α）和DEK蛋白的研究均有，然而能同时靶向TNF-α和DEK的体系并没有，并且如何将不同靶向的适配体结合到一起，并且保有二者的功能，同时还可以提高载药体系的稳定性，是本课题要解决的技术问题。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提出一刺激-响应型双靶点DNA纳米治疗体系及其构建方法和应用，克服了传统药物递送系统存在的技术问题。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种刺激-响应型双靶点DNA纳米治疗体系的构建方法，步骤如下：

（1）将三条ssDNA（DTA-S12、TR1S-9、Apt_ATP）溶于缓冲盐溶液中，慢退火自组装形成ATP响应性的双靶点DNA纳米结构溶液（DAT）；

（2）向步骤（1）得到的DNA纳米结构溶液中加入ATP溶液，孵育后得双靶点DNA纳米治疗体系。

优选的，所述步骤（1）中三条单链直链DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3。

优选的，所述ssDNA的物质的量浓度为2.5 μΜ，三条链物质的量比为1:1:1。