[发明专利]一种去除口蹄疫抗原液中内毒素的方法

说明书

本发明涉及一种去除口蹄疫抗原液中内毒素的方法，采用强阴离子交换层析进行分离，包括如下步骤：(1)平衡：用平衡液对层析柱进行平衡；(2)调节：根据口蹄疫抗原液的内毒素含量计算上样体积，需满足上样总内毒素含量低于层析柱最大载量，取计算体积的所述抗原液调节电导率至18～22mS/cm后上样；(3)收集：所述抗原液上样后，当紫外吸收曲线上升时开始收集层析透过液，上样结束后继续用所述平衡液进柱，同时继续收集层析透过液，直至紫外吸收曲线降至趋于平缓；(4)再生：用再生液对层析柱进行再生。本发明方法操作简单、适于大规模生产应用，抗原回收率高，内毒素去除率高。

技术领域

本发明涉及兽药领域，具体涉及一种去除口蹄疫抗原液中内毒素的方法。

背景技术

口蹄疫是猪、牛、羊等主要家畜和其它家养、野生偶蹄动物共患的一种急性、热性、高度接触性传染病，易感动物达70多种。临床特征是在口腔黏膜、蹄部和乳房皮肤发生水疱性疹。该病传播途径多、速度快，曾多次在世界范围内暴发流行，造成巨大政治、经济损失。鉴于此，世界动物卫生组织(OIE)将其列为A类传染病之首。目前，有三分之二的OIE成员国流行FMD，时刻威胁着无FMD国家和地区的家畜安全和畜产品贸易。

口蹄疫病毒属于微核糖核酸病毒科口蹄疫病毒属。其最大颗粒直径为23纳米，最小颗粒直径为7-8纳米。口蹄疫病毒目前有O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3(即南非1、2、3型)和Asia1(亚洲1型)7个血清型。各型之间几乎没有免疫保护力，感染了一型口蹄疫的动物仍可感染另一型口蹄疫病毒而发病。病毒外壳为对称的20面体。

目前口蹄疫疫苗采用最多的形式依然是完整病毒灭活疫苗，灭活疫苗是使用口蹄疫灭活抗原与油乳佐剂混合乳化而成的。其中口蹄疫灭活抗原由口蹄疫活病毒经灭活剂BEI(二乙烯亚胺)灭活而来，破坏病毒核酸使其丧失复制能力，但保留了完整的病毒外壳，即口蹄疫抗原。由于口蹄疫抗原完整颗粒的沉降系数为146S，因此一般也会将口蹄疫抗原代称作146S。

离子交换层析可以用于蛋白质的分离纯化。离子交换层析的基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有负电荷的称之阳离子交换树脂；而带有正电荷的称之阴离子树脂。由于蛋白质有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或提高洗脱液的pH值洗脱下来。

本领域中有多种去除抗原液中内毒素的方法。

吸附过滤法的原理是利用含有活性炭的滤板或滤器对口蹄疫抗原液进行过滤，活性炭具有大量微孔，可吸附大多数有机物和部分无机物，其对内毒素也具有较强的吸附能力。这种方法操作简单，对其它杂蛋白也有一定程度的吸附去除。但是，活性炭的吸附力无选择性，对口蹄疫抗原也具有一定吸附性，因此吸附过滤法处理过程的抗原损失率较大，一般可达40％。

针对亲和层析法而言，对分离口蹄疫抗原与内毒素的亲和层析有两个方向，一是采用适合口蹄疫抗原吸附的特异性基团结合的层析介质，其可以特异性吸附口蹄疫抗原；二是采用适合吸附内毒素的特异性基团(如多粘菌素B)的层析介质，其可以特异性吸附内毒素。这种方法内毒素去除率高。但是，亲和层析介质制作困难，且口蹄疫病毒血清型毒株繁多，不同毒株不同培养方式产出抗原所对应的亲和介质均有差异，导致这种方法成本极高，不适用于大规模生产应用。

凝胶过滤层析法的原理是利用凝胶的网状结构，根据分子大小进行分离的一种方法，口蹄疫抗原分子量明显高于内毒素，因此可经凝胶过滤使两者分离。但是，凝胶过滤层析法单次上样量极小，分离效率低、操作要求多。