[发明专利]一种兽用重组绒促性素的纯化方法

说明书

本发明涉及蛋白质纯化技术领域，具体公开一种兽用重组绒促性素的纯化方法。本发明提供的纯化方法包括，MMC复合层析、离子交换层析和疏水层析。经过上述的纯化方法，得到的重组hCG纯度高(98％以上)、比活高(20900IU/mg)，并且纯化得率高(65％以上)。整个生产过程不涉及污染环境有机溶剂、更环保、成本更低，可适用于兽用rhCG大规模纯化。

技术领域

本发明涉及蛋白质纯化领域，特别是兽用重组人绒毛膜促性腺激素(rhCG)的纯化。

背景技术

人绒毛膜促性激素(hCG)是一种由人胎盘合体滋养层细胞分泌的糖蛋白激素，可以促进雌性动物卵巢卵泡成熟，诱导排卵，以及促进雌激素的合成和分泌。在人临床上，hCG常用于辅助生殖治疗，治疗不孕不育等。在动保行业，hCG常用于母畜，包括猪、牛、羊等的同期发情和超数排卵。在水产行业，hCG常用于鱼类的人工催熟催产、排卵产精，是鱼类人工繁殖的首选催产剂之一。

商品化hCG最初是从孕妇尿中提取纯化的提取物，但大规模收集孕妇尿难度大、成本高，纯化得到的hCG产品批次差异大，且存在尿液供体带来的安全风险。Merck Serono研发了重组hCG，以用于人辅助生殖，连续使用五步色谱层析，最终获得效价为25000IU/mg的高纯度、高活性重组hCG产品(CN 100482679C)，但是纯化过程复杂、得率低，纯化成本高。目前国内已公开数据显示，经纯化后的rhCG单位效价大多都≤10000IU/mg，如发明专利CN102485752B、CN111303274A、CN105968185A等。但在纯化过程中均不同程度的使用了污染环境或有害试剂如异丙醇、二硫苏糖醇(DTT)和β-巯基乙醇等，存在环境污染的风险。

本发明提供了一种兽用重组人绒毛膜促性腺激素(rhCG)的纯化方法，仅需3步常规层析步骤，无层析柱装柱技术特别要求，操作简便，不会因此增加工艺放大困难系数。纯化纯度在98％以上，得率高，得率至少65％，纯化原液比活达20000IU/mg。比活高，成本低，满足低附加值的畜牧和水产生产。另外，整个生产过程不涉及有机溶剂，环境友好、更环保。

发明内容

本发明的目的是解决重组hCG，尤其是哺乳动物细胞表达的rhCG的纯化问题，得到纯度高、活性高的兽用重组hCG精纯品。

本发明的另一目的是提供一种可适用于大规模生产的重组hCG纯化工艺。

为了达到上述目的，本发明提供了以下的重组hCG纯化步骤：

(0)深层过滤；

(1)MMC复合层析；

(2)离子交换层析；

(3)疏水层析。

其中，各纯化步骤按先后顺序进行。

在本发明所述的重组hCG纯化方法中，纯化起始材料为使用哺乳动物细胞-中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达系统表达的细胞培养上清液，也适用其他表达系统，包括但不限于大肠杆菌、酵母细胞，表达获得的培养上清液。

在本发明所述的重组hCG纯化方法中，在复合层析步骤之前，为了去除较大颗粒，以免堵塞柱子，最好进行一次深层过滤步骤。

在本发明所述的重组hCG纯化方法中，所述的步骤(1)采用一种偶联复合型阳离子配基MMC复合层析介质。

在本发明所述的重组hCG纯化方法中，所述的步骤(1)中，洗脱优选弱酸性缓冲液。适合的缓冲液包括NaAC/HAC缓冲液、Tris-HCl缓冲液，磷酸盐缓冲液。最优选pH5.5的NaAC/HAC缓冲液。

在本发明所述的重组hCG纯化方法中，所述的步骤(1)中，NaAC/HAC洗脱缓冲液的浓度在10～100mM；优选50mM。