[发明专利]一种高活性腈水合酶突变体及其应用

说明书

本发明提供了一种高活性腈水合酶突变体及其应用，属于生物工程技术领域。本发明通过对来源于R.rhodochrous J1的腈水合酶H‑NHase的氨基酸进行改造，将腈水合酶β亚基上的第48号位的色氨酸突变为酪氨酸，得到的突变体W48Y对烟腈的催化活力较野生型显著提升，比酶活可达1097U/mg，适于酰胺生产等工业领域。

技术领域

本发明涉及一种高活性腈水合酶突变体及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

腈水合酶(Nitrile hydratase，简称NHase，EC 4.2.1.84)，是一类可以催化腈类物质通过水合反应转化为高附加值酰胺类化合物的金属酶，在大宗化学品丙烯酰胺的工业生产上已经被广泛应用。目前，腈水合酶以其绿色环保、反应条件较温和、安全系数高等优势，而逐渐替代传统的化学法，使得酰胺类的生产符合可持续发展和绿色生产理念。

腈水合酶通常由α和β两个亚基构成，研究发现，目前已报道的原核生物来源的腈水合酶大都存在稳定性差、催化活性低、催化底物谱窄的问题。也有很多研究尝试对其进行了改造，来提高其相关的性质。但是目前的催化效率不高、底物谱窄等问题仍然限制着腈水合酶进一步的开发和应用。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种腈水合酶突变体，所述突变体是以来源于R.rhodochrousJ1的腈水合酶H-NHase为亲本；所述腈水合酶亲本的α亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，β亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述突变体为将β亚基的第48位发生取代。

在一种实施方式中，所述突变体为将亲本第48位取代为酪氨酸。

本发明的第二个目的是提供编码所述突变体的基因。

本发明的第三个目的是提供含有所述基因的表达载体。

在一种实施方式中，所述表达载体包括但不限于pET系列、Duet系列、pGEX系列、pHY300、pHY300PLK、pPIC3K或pPIC9K系列载体。

在一种实施方式中，所述表达载体优选为pET-24a(+)。

本发明的第四个目的是提供表达所述突变体、或含有所述基因的宿主细胞。

在一种实施方式中，所述宿主细胞包括大肠杆菌、毕赤酵母、枯草芽孢杆菌；优选的，所述宿主细胞为E.coli BL21(DE3)。

本发明的第五个目的是提供一种制备酰胺类物质的方法，所述方法以腈类物质为底物，利用所述突变体催化生成酰胺类物质。

在一种实施方式中，所述腈类物质包括异丁腈、正戊腈、丙烯腈、烟腈、2-氰基吡嗪、苯甲腈、肉桂腈和萘甲腈。

在一种实施方式中，所述酰胺类物质包括异丁酰胺、戊酰胺、丙烯酰胺、烟酰胺、吡嗪酰胺、萘甲酰、苯甲酰胺和肉桂酰胺。

本发明的第五个目的是提供所述突变体、或所述基因、或所述宿主细胞在生产酰胺类物质中的应用。

在一种实施方式中，所述酰胺类物质包括但不限于异丁腈、正戊腈、丙烯腈、烟腈、2-氰基吡嗪、苯甲腈、肉桂腈和萘甲腈。

本发明的有益效果：本发明将来源于Rhodococcusrhodochrous的腈水合酶进行突变，所述突变体为对β亚基上的48号位的色氨酸突变为酪氨酸，将得到突变体W48Y在宿主中表达后，通过纯化得到纯酶。该腈水合酶在pH7.4条件下催化烟腈形成烟酰胺，最高比活可达1097U/mg。突变体的比酶活较野生型有较显著的提高，提升了8倍以上。

附图说明

图1为纯酶的SDS-PAGE电泳图；M：蛋白Marker；BAG：来源于R.rhodochrous J1的H-NHase野生型；48Y：将野生型β亚基上的48号位的色氨酸突变为酪氨酸的突变体。